[發明專利]用于檢測硫酸鹽還原菌的引物和熒光探針

無效

• 申請號: 200710072332.0
• 申請日: 2007-06-08
• 公開（公告）號: CN101089195A
• 公開（公告）日: 2007-12-19
• 發明（設計）人: 魏利;馬放;李維國
• 申請（專利權）人: 哈爾濱工業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N33/52
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所
• 代理人: 單軍

技術領域

本發明涉及用于檢測微生物的引物和探針。

背景技術

硫酸鹽還原菌(sulfate?reducing?bacteria，SRB)是一類與硫酸鹽還原反應相關的細菌的總稱。由革蘭氏陰性菌(如脫硫弧菌屬Desulfovibrio，脫硫桿菌屬Desulfobacterium)、革蘭氏陽性菌(脫硫腸狀菌屬Desulfotomaculum)、嗜熱細菌(熱脫硫菌屬Thermodesulfobacterium)和嗜熱古細菌(古生球菌屬Archaeoglobus)等多種微生物構成。

SRB菌通過一系列復雜的生物化學反應將硫酸鹽還原成H₂S和大量的硫化物，硫化物和H₂S不僅腐蝕油田生產設備；而且其腐蝕產物(金屬硫化物)不溶于水，導致污水發黑、懸浮固體含量增加，使處理后水中懸浮固體含量超標，嚴重的危害了油田的正常生產。因此，快速定量檢測硫酸鹽還原菌對于油田水質檢測和地面系統殺菌劑濃度的合理調節具有重要的生產指導意義。但是，目前SRB菌的定量檢測方法(如：絕跡稀釋法等)存在檢測時間長、非特異性高、檢測結果偏低的缺陷。

發明內容

本發明的目的是為了解決目前SRB菌的定量檢測方法存在檢測時間長、非特異性高、檢測結果偏低的缺陷，而提供的用于檢測硫酸鹽還原菌的引物和熒光探針。

用于檢測硫酸鹽還原菌的上游引物基因序列為5’-CGCTGAAATGACCATGATGG-3’；下游引物基因序列為5’-CGCGCATTTCACGAAGC-3’。

用于檢測硫酸鹽還原菌的熒光探針由報告熒光基團、淬滅熒光基團和探針基因序列組成；探針基因序列為5’-CTGAAGCCTTACGAAGATCG-3’，探針基因序列5’端標記的報告熒光基團是FAM，探針基因序列3’端標記的淬滅熒光基團是TAMRA。

SO₄^2-/SO₃^2-的氧化還原電位太低，致使硫酸根(或亞硫酸根)不能直接接受電子，因此硫酸根(或亞硫酸根)離子的還原首先需要硫酸根(或亞硫酸根)離子活化。在硫酸腺苷轉移酶的作用下硫酸鹽還原菌以ATP為代價將硫酸根離子激活，經過復雜的生物化學反應生成H₂S。所以，腺苷酰硫酸還原酶(adenosine-5′-phosphosulfate?reductase，APS)是硫酸鹽還原菌還原硫酸鹽生成H₂S的關鍵酶。腺苷酰硫酸還原酶是一種寡聚鐵硫黃素蛋白，含有一分子黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和12個原子的鐵和不穩定硫；APS基因在硫酸鹽還原菌中具有保守性結構框架，APS蛋白結構中包含有典型的硫酸鹽-亞硝酸鹽還原酶的保守框架CP-X_n-C-X₂-C-X₂-C框架，能與[4Fe4S]結合，是SRB菌共有的一個穩定靶位點；所以，本發明根據腺苷酰硫酸還原酶基因序列的保守區域設計了具有特異性的引物和熒光探針。本發明引物和熒光探針特異性高，在引物和熒光探針的雙重作用下假陽性大幅降低。使用本發明的引物和熒光探針進行熒光定量PCR檢測硫酸鹽還原菌，檢測時間短、從樣本的模板DNA提取到熒光定量PCR檢測全過程僅需6h。

附圖說明

圖1是具體實施方式四中以pGEM-T-DSR為底物的PCR擴增曲線圖，圖1中曲線①模板濃度為5.65×10⁷copies/μL的PCR擴增曲線，②模板濃度為5.65×10⁶copies/μL的PCR擴增曲線，③模板濃度為5.65×10⁵copies/μL的PCR擴增曲線，④模板濃度為5.65×10⁴copies/μL的PCR擴增曲線，⑤模板濃度為5.65×10³copies/μL的PCR擴增曲線，⑥模板濃度為0?copies/μL的PCR擴增曲線；圖2是具體實施方式四中硫酸鹽還原菌熒光定量檢測標準曲線圖。

具體實施方式

具體實施方式一：本實施方式用于檢測硫酸鹽還原菌的上游引物基因序列(FP)為5’-CGCTGAAATGACCATGATGG-3’；下游引物基因序列(RP)為5’-CGCGCATTTCACGAAGC-3’。

本實施方式檢測引物根據APS基因在硫酸鹽還原菌中具有的保守性結構框架而特異性設計、合成。