[發明專利]快速定量檢測活的雙歧桿菌的方法

無效

• 申請號: 200710072321.2
• 申請日: 2007-06-06
• 公開（公告）號: CN101319250A
• 公開（公告）日: 2008-12-10
• 發明（設計）人: 孟祥晨;龐睿;王超
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06
• 代理公司: 哈爾濱東方專利事務所
• 代理人: 陳曉光

1.一種快速定量檢測活的雙歧桿菌的方法，其特征是：取樣后，將樣品 10倍稀釋后，進行EMA處理，然后提取樣品的DNA，進行分子信標-實時 PCR檢測，根據標準曲線計算雙歧桿菌的含量，所述的DNA提取過程是： EMA處理后的含雙歧桿菌制品，加入18％的檸檬酸鈉和1M?NaOH， 10000rpm離心10min，收集菌體細胞，用無菌超純水洗滌后，懸浮于無菌超 純水中，取菌懸液，加入到濃度為2％的Tritox-100液中，100℃水浴處理10min 后，立即置于冰水中冷卻，所得上清液直接用于分子信標-實時PCR擴增， 所述的含雙歧桿菌制品的重量份數為1，所述的檸檬酸鈉的重量份數為0.15， 所述的NaOH的重量份數為0.1，所述的無菌超純水的重量份數為0.1，所述 的菌懸液的重量份數為0.01，所述的Tritox-100液的重量份數為0.1，所述的 EMA處理：EMA用量終濃度為1.5μg/mL，在650W鹵素光源照射時間為 2min，所述的分子信標-實時PCR檢測，其引物/探針濃度比為 0.8μM/0.4μM，熒光信號采集的退火溫度為40℃，Mg²⁺濃度為2.5mM，循 環參數為：

所述的引物包括正向引物和反向引物，其中Bif-F為正向引物，長度為19bp， 序列為5′-TCTGGCTCAGGATGAACGC-3′，結合位點落在長雙歧桿菌16S rDNA序列的20～38bp號位置；Bif-R為反向引物，長度為20bp，序列為 5′-CACCGTTACACCGGGAATTC-3′，結合位點落在長雙歧桿菌16S?rDNA 序列的655～674bp號位置，所述的分子信標探針5′端標記熒光基團FAM，6- 羥基熒光素，熒光發射峰值在518nm處，3′端標記淬滅基團DABCYL，4-4′- (惡烷氨基苯偶氮)苯甲酸，熒光發射峰值在491nm處，兩者之間構成能量 傳遞結構，分子信標序列為：

5′-FAM-CCAGGCATCCGGCATTACCACCCGTCCTGG-3′-DABCYL。

2.根據權利要求1所述的快速定量檢測活的雙歧桿菌的方法，其特征是： 所述的取樣：無菌操作將充分混勻的含雙歧桿菌制品的樣品放入含有PBS緩 沖液的滅菌錐形瓶內做成1∶10的均勻稀釋液，室溫靜置水合30min。

3.根據權利要求1所述的快速定量檢測活的雙歧桿菌的方法，其特征是： 所述的分子信標-實時PCR檢測的方法的標準曲線是：以不同菌數的陽性模 板對數為橫坐標，以PCR反應過程中出現熒光信號的初始循環數Ct為縱坐 標繪制雙歧桿菌的標準曲線，濃度范圍在2×10⁸～2×10⁴CFU/ml之間時，標 準曲線線性良好，相關系數R值大于0.97，所建立分子信標-實時PCR檢測 標準曲線，Y＝-3.568X+42.322。