[發(fā)明專(zhuān)利]一種甘蔗脫毒組培快繁的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710070957.3
• 申請(qǐng)日: 2007-08-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101138321A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-03-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐剛;汪一婷;牟豪杰;呂永平;陳劍平
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): A01H4/00
• 分類(lèi)號(hào): A01H4/00;C12N5/04;A01G31/00
• 代理公司: 杭州豐禾專(zhuān)利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 沈伾伾

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物脫毒組培快繁技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種甘蔗脫毒組培快繁的方法。

背景技術(shù)

甘蔗花葉病害在浙江和福建等省廣泛發(fā)生已有多年，新葉呈現(xiàn)淺黃色斑駁或輕微的褪綠條紋，老葉呈現(xiàn)長(zhǎng)條褪綠條紋或花葉，發(fā)病率很高，造成糖分和產(chǎn)量下降(約18％左右)，種性也衰退，影響品質(zhì)。

獲得無(wú)病毒植株的方法有多種，例如熱處理脫毒、莖尖培養(yǎng)脫毒和莖尖微嫁接脫毒以及組合方法。其中普遍采用的較好的方法是莖尖培養(yǎng)脫毒法，具體的步驟是：通過(guò)植物頂端分生組織切取莖尖(0.2mm以下分生組織)，誘導(dǎo)產(chǎn)生幼芽，長(zhǎng)成小植株得到脫毒苗。相關(guān)的技術(shù)已有許多的專(zhuān)利。例如，CN1031637A、CN1238122A、CN1258435A、CN1258436A披露了采用莖尖作為外植體，經(jīng)莖尖培養(yǎng)后得到脫毒苗的方法。但是這種莖尖分生組織脫毒法存在的問(wèn)題是：要切取很微小的0.2mm以下莖尖分生組織，需在顯微鏡下操作，具有一定難度；而且，切取莖尖組織越小，成活率就越低，而切取莖尖組織偏大，又不能完全脫除病毒，同時(shí)容易造成污染；因此，生產(chǎn)上迫切需要一種更好的方法來(lái)滿(mǎn)足甘蔗脫毒組培快繁的需要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是針對(duì)上述莖尖分生組織脫毒法所存在的操作難度大、成活率低等缺陷，提出一種以切取較大的甘蔗植株莖尖(2～3mm)為外植體，先誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，再分化形成植株的方法，達(dá)到大量、快速、操作方便、脫毒徹底地繁殖甘蔗脫毒組培苗的目的。

本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

一種甘蔗脫毒組培快繁的方法，按如下步驟進(jìn)行：

1)培養(yǎng)基的配制，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含重量為：

(1)基本培養(yǎng)基：用MS培養(yǎng)基，蔗糖或白糖20～30g/L，瓊脂7～9g/L，pH5.6～5.8；

(2)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS中添加2，4-D?1～2mg/L和NAA?0.1～0.2mg/L；

(3)分化培養(yǎng)基：MS中添加6-BA2.0～3.0mg/L和NAA?0.1～0.3mg/L；

(4)增殖培養(yǎng)基：MS中添加6-BA0.5～1.0mg/L和NAA0.1mg/L；

(5)生根培養(yǎng)基：1/2MS中添加NAA0.1～0.5mg/L；

2)外植體的選取與滅菌：取甘蔗的頂芽或腋芽，經(jīng)滅菌處理，作為脫毒組培用的外植體；

3)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟2)滅菌處理后的頂芽或腋芽在無(wú)菌條件下，摘取其2～3mm的莖尖組織，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)形成愈傷組織；

4)分化培養(yǎng)：將步驟3)誘導(dǎo)形成的愈傷組織移植至分化培養(yǎng)基分化出叢芽；

5)增殖培養(yǎng)：將步驟4)分化的叢芽切成單株接種在增殖培養(yǎng)基上，再分化出叢芽；

6)生根培養(yǎng)：將步驟5)增殖形成的叢芽切成單株接種在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)；

7)移栽：當(dāng)步驟6)的生根組培苗生長(zhǎng)至3～5cm，根數(shù)5根以上時(shí)，移栽基質(zhì)培養(yǎng)至成苗；

8)病毒檢測(cè)：利用RT-PCR擴(kuò)增技術(shù)，構(gòu)建其基因組序列克隆，原核表達(dá)制備病毒特異性的抗血清，建立ELISA檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行甘蔗花葉病毒檢測(cè)。

所述的培養(yǎng)基進(jìn)一步可改進(jìn)為，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含重量為：

(1)基本培養(yǎng)基：用MS基本培養(yǎng)基，白糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.8；(2)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+2，4-D?1.5mg/L+NAA?0.15mg/L；(3)分化培養(yǎng)基：MS+6-BA?2.5mg/L+NAA?0.15mg/L；(4)增殖培養(yǎng)基：MS+6-BA?0.75mg/L+NAA?0.1mg/L；(5)生根培養(yǎng)基：1/2MS+NAA?0.25mg/L。

所述的滅菌處理是將外植體先經(jīng)75％酒精浸泡0.5～1.0min，再用0.1％升汞溶液滅菌10～15min，最后用無(wú)菌水沖洗3～5次。

所述的移栽基質(zhì)是泥炭∶珍珠巖∶蛭石按體積比3∶1∶2配制而成。本發(fā)明的有益效果是：

1)本發(fā)明利用甘蔗的頂芽和腋芽為脫毒組培的外植體，由于莖尖培養(yǎng)時(shí)摘取其2～3mm長(zhǎng)的莖尖組織，體積較大接種操作就較容易；接種成功率高達(dá)90％以上，而現(xiàn)有以脫毒為目的僅摘取0.2～0.3mm的莖尖組織，其培養(yǎng)接種成活率一般只有20％～40％；