[發明專利]副溶血性弧菌的實時FQ-PCR檢測試劑盒及檢測方法

無效

• 申請號: 200710070688.0
• 申請日: 2007-09-06
• 公開（公告）號: CN101381765A
• 公開（公告）日: 2009-03-11
• 發明（設計）人: 王志錚;王忠發;楊陽;王虹玲
• 申請（專利權）人: 浙江海洋學院;舟山市疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

(一)發明領域

本發明涉及微生物測量的組合物，具體地說是涉及一種副溶血性弧菌的實時FQ-PCR檢測試劑盒及檢測方法，FQ-PCR即為實時熒光定量聚合酶鏈反應。

(二)背景技術

副溶血性弧菌(vibrio?parahaemolyticus，vp)是一種嗜鹽性細菌，屬弧菌科(vibrio)弧菌屬，存在于近海的海水、海底沉積物和魚類、蝦類、貝殼類等海產品中，是我國大陸沿海地區食物中毒和急性腹瀉的主要病原菌。神奈川現象(Kanagawa?phenomenon，kp)陽性菌株為致病菌株，該菌株含兩種致病因子基因(tdh與trh)，從tdh與trh基因序列中設計的PCR引物可使神奈川現象陰性菌株漏檢。不能完整地反映食品中副溶血性弧菌污染的詳細情況。

目前，我國食品副溶血性弧菌國家標準檢測方法是細菌培養法(GB4789-2003)，國標要求檢測食品中所有副溶血性弧菌，但國標方法需經增菌、分離培養、生化鑒定、血清凝集等，存在操作繁瑣、所需時間長(約4天)等不足。

隨著微生物基因組學的發展，近年來又出現了一種實時熒光定量PCR技術，該技術把熒光標記、探針、計算機與PCR四種技術融為一體，是目前國際上公認的最靈敏、特異、重復性最好的核酸定性定量檢測方法(本領域內普遍技術人員都知道)。根據副溶血弧菌的不耐熱溶血索基因Thermolabile?hemolysin或簡稱TLH的序列設計引物，可以進行所有已知的副溶血性弧菌的常規PCR檢測。但是直接使用常規的PCR檢測試劑盒來檢測副溶血性弧菌，尚存在下列難以解決的技術問題：1、常規的PCR檢測試劑盒的反應管內不含有TaqMan探針，必須“開蓋操作”將PCR產物轉移，進行瓊脂糖電泳或Southem轉移雜交等實驗對PCR產物進行鑒定，容易污染，造成假陽性，而且耗費時間(4-5小時)，國家衛生部已限制其在臨床上使用；2、常規PCR檢測試劑盒不含標準品，不能對副溶血性弧菌進行定量檢測；3、常規PCR檢測試劑盒不能對副溶血性弧菌進行實時監測；4、常規PCR檢測試劑盒靈敏度低。

(三)發明內容

本發明的目的是提供一種可定量定性、操作簡便、實時快速、特異度好、靈敏度高、重復性好的副溶血性弧菌的實時FQ-PCR檢測試劑盒及檢測方法，解決目前在副溶血性弧菌檢測中需經增菌、分離培養、生化鑒定、血清凝集等步驟，從而使操作繁瑣、所需時間長等不足，并能實現快速檢測所有副溶性弧菌的效果。

所述的副溶血性弧菌的實時FQ-PCR檢測試劑盒由以下試管和各部分組成：副溶血性弧菌的實時FQ-PCR檢測試劑盒包括：PCR反應液管、樣本處理液管、陽性對照管、陰性對照管、標準品管、去離子水管。

(1)、2×PCR反應液：內含2×PCR緩沖液、Taq酶、Mg++、KCl，序列為5′-CAC?GCA?TTG?CGCTCT?GAG?T-3′的上游引物、序列為5′-CGA?GAC?ATC?CCA?GAA?CAC?AAA-3′的下游引物、序列為5′-FAM-TCG?GGC?GTC?TGG?TGC?TGA-TAMRA-3′的TaqMan探針、去離子水；

(2)、DNA提取劑：內含0.9％NaCl和0.1％二硫基乙醇；

(3)、陽性對照管：內含副溶血性弧菌TLH基因；

(4)、陰性對照管：不含副溶血性弧菌TLH基因；

(5)、標準品管：病毒拷貝數濃度，2×10⁷cfu/ml、2×10⁶cfu/ml、2×10⁵cfu/ml、2×10⁴cfu/ml、10μM上游引物、10μM下游引物、3μM?TaqMan探針；

(6)、去離子水管：管內試劑為去離子水，即為無菌雙蒸水。

副溶血性弧菌的實時FQ-PCR檢測試劑盒中，其2×PCR反應液濃度為兩倍稀釋，上游引物濃度為10μM，下游引物濃度為10μM，TaqMan探針濃度為3μM，雙蒸水各試劑的體積比為：2×PCR反應液∶上游引物∶下游引物∶TaqMan探針＝100∶4∶4∶4∶68。

所述的檢測方法，是副溶血性弧菌的實時FQ-PCR檢測試劑盒用于快速檢測所有副溶性弧菌的方法，該檢測方法由下列步驟組成：先采集和處理待測標本再進行加樣。

(1)、每份PCR反應液的配制；

(2)、溶血性弧菌模板制備；

(3)、標準品與陰性對照，陽性對照模板制備的各步驟與溶血性弧菌模板制備相同；；

(4)、待測樣品、標準品；

(5)、預變性；