[發(fā)明專利]牛奶樣品布氏桿菌套式PCR檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710070130.2
• 申請(qǐng)日: 2007-07-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101100693A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-01-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周繼勇;郭軍慶;杜振昆
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 馮子玲

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及基因工程技術(shù)，具體為牛奶樣品布氏桿菌的套式PCR檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

布氏桿菌病(Brucellosis)又稱馬爾他熱或波狀熱，是由布氏桿菌屬(Brucella)引起的人畜共患的自然疫源性傳染病，對(duì)人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)都有嚴(yán)重危害，1859年由Morston首次報(bào)道。布氏桿菌可感染人類、多種家畜和野生動(dòng)物，引起相似的臨床癥狀與病理?yè)p傷，如發(fā)熱、流產(chǎn)與不育、慢性關(guān)節(jié)炎及神經(jīng)損害等，可導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。家畜布氏桿菌病常發(fā)于豬、羊和牛，是人類布氏桿病的主要傳染源。布氏桿菌傳染性強(qiáng)、傳播迅速，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為B類動(dòng)物疫病，我國(guó)列為二類動(dòng)物疫病。1995年以來(lái)，我國(guó)人畜布氏桿菌疫情明顯回升，2000年以后開(kāi)始呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，局部地區(qū)甚至出現(xiàn)爆發(fā)，衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示1994年布病新發(fā)病人數(shù)為815人，發(fā)病率0.05/10萬(wàn)，到2005年新發(fā)病人數(shù)已經(jīng)接近2萬(wàn)人，發(fā)病率高達(dá)1.41/10萬(wàn)，比2004年增加60.2％，疫情形勢(shì)十分嚴(yán)峻。

布氏桿菌病是國(guó)際貿(mào)易檢疫中必檢的傳染病，我國(guó)每年均開(kāi)展對(duì)奶牛的布氏桿菌病的普查和監(jiān)控。目前，我國(guó)所采用的布氏桿菌檢測(cè)技術(shù)包括虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)、試管凝集試驗(yàn)(SAT)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)等，均不能適應(yīng)現(xiàn)代檢驗(yàn)檢疫需求。RBT和SAT等凝集試驗(yàn)雖然操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短，但存在假陽(yáng)性反應(yīng)，OIE已取消其作為布氏桿菌病的檢測(cè)方法；CFT則操作繁瑣，實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)水平要求高，無(wú)法在基層單位開(kāi)展。因此，迫切需要建立新型的快捷、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)具有很高的特異性和敏感性，用于檢測(cè)布氏桿菌特異性抗體，但不能將疫苗免疫與致病菌感染的抗體相區(qū)別。在病原檢測(cè)方面，針對(duì)布氏桿菌保守基因(如BCSP31、16S?rRNA)的PCR檢測(cè)方法相繼建立，但多限于對(duì)布氏桿菌純培養(yǎng)物或提純?nèi)旧wDNA的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，并顯示不同的敏感性(20-100CFU/mL或8fg-20pg)，尚未建立對(duì)臨床樣品(特別是牛奶及其制品)的檢測(cè)技術(shù)，遠(yuǎn)不能滿足動(dòng)物布氏桿菌病檢驗(yàn)檢疫和監(jiān)控的實(shí)際需求。由于牛奶及其制品中存在大量乳脂和蛋白質(zhì)等多種非特異性影響因素，嚴(yán)重影響牛奶樣品細(xì)菌染色體DNA的提取效率，因此直接從牛奶樣品檢測(cè)布氏桿菌DNA存在較大難度。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供直接從牛奶樣品中直接檢測(cè)布氏桿菌的套式PCR檢測(cè)方法，為奶牛布氏桿菌病普查和監(jiān)測(cè)，以及牛奶制品的食品安全監(jiān)控提供新的技術(shù)手段。

本發(fā)明所建立的牛奶樣品布氏桿菌套式PCR檢測(cè)方法，可以套式PCR引物直接從牛奶樣品中檢測(cè)布氏桿菌特異性DNA片段。

用3.4％十二烷基磺酸鈉(SDS)裂解牛奶樣品沉淀，經(jīng)1mg/mL蛋白酶K和RNaseA消化，以優(yōu)化的CTAB-NaCl法提取牛奶樣品細(xì)菌染色體DNA，以套式PCR引物直接從牛奶樣品中檢測(cè)布氏桿菌特異性DNA片段。套式PCR引物的外向引物為：5’-TCGAGCGCCCGCAAGGGG-3’和5’-AACCATAGTGTCTCCACT?AA-3’，內(nèi)向引物為：5’-ATCGGCAAATGATCGGCC-3’和5’-TACTCCCCAGGCGGAATG?TT-3’，分別擴(kuò)增903bp和628bp布氏桿菌16S?rRNA特異性DNA片段。

本發(fā)明的詳細(xì)步驟如下：

(1)將牛奶樣品沉淀用NET溶液懸浮，在懸浮液中加入10％十二烷基磺酸鈉(SDS)，至終濃度為：SDS重量占懸浮液體積的3.4％(w/v)，裂解牛奶樣品沉淀，獲牛奶樣品裂解液；

(2)在每毫升牛奶樣品裂解液中加入1毫克蛋白酶K和1毫克RNaseA消化，獲牛奶樣品裂解消化液；

(3)以CTAB-NaCl法從牛奶樣品裂解消化液中提取牛奶樣品細(xì)菌染色體DNA；

(4)用套式PCR引物直接從牛奶樣品細(xì)菌染色體DNA中檢測(cè)布氏桿菌特異性DNA片段。

套式PCR引物的外向引物為：5’-TCGAGCGCCCGCAAGGGG-3’和5’-AACCATAGTGTCTCCACT?AA-3’，內(nèi)向引物為：5’-ATCGGCAAATGATCGGCC-3’和5’-TACTCCCCAGGCGGAATG?TT-3’，分別擴(kuò)增903?bp和628?bp布氏桿菌16S?rRNA特異性DNA片段。