[發明專利]人小RNA129熒光定量試劑盒

無效

• 申請號: 200710069338.2
• 申請日: 2007-06-15
• 公開（公告）號: CN101126705A
• 公開（公告）日: 2008-02-20
• 發明（設計）人: 王剛;張紅河
• 申請（專利權）人: 杭州市第一人民醫院
• 主分類號: G01N21/00
• 分類號: G01N21/00;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術領域

本發明屬生物技術領域，為一種通過逆轉錄(RT)microRNA樣品得到cDNA，再結合實時熒光定量PCR檢測技術，可以精確定量檢測標本中hsa-microRNA-129(hsa-miR-129，人小RNA?129)表達量的試劑盒。

背景技術

microRNA(miRNA)是一類新發現的非編碼小RNA分子，長度為22nt左右，來自于基因組DNA的基因間隔區或者斷裂的內含子中，自身不編碼蛋白，目前在人中發現了587種miRNA(microrna.sanger.av.uk/targets/v4)，hsa-miR-129是其中的一個家族。miRNA的發現被美國《科學》雜志評為2002年年度十大科技突破成果，并被排在首位。

miRNA基因首先轉錄產生幾百至幾千nt的初級產物(pri-miRNA)，在核內被RNaseIII內切酶家族Drosha酶切割成70nt左右的發夾狀前體(pre-miRNA)。Pre-miRNA在Ran-GTP和轉運蛋白Exportin-5的協同作用下轉運出核，然后經Dicer酶切割成約22nt的成熟miRNA。成熟的miRNA在RNA誘導沉默復合物(RNA-induced?silencing?complex，RISC)引導下與互補mRNA完全或不完全配對，降解靶mRNA或阻遏其轉錄后翻譯。這類非編碼的小RNA分子通過調節基因的表達在生物發育、脂肪代謝、細胞的分化、增殖和凋亡等過程中發揮著重要作用。近期一些研究表明miRNA與腫瘤的發生及分化密切相關，在胰腺癌、肺癌、白血病和肝癌等腫瘤中均有報道，提示miRNA與腫瘤的發生有一定的關系。最近研究發現let-7可與肺癌細胞中的癌基因HMGA2(a?high-mobility?groupprotein)多靶點mRNA的3’非翻譯區(3’UTR)結合，但其在肺癌中的生長抑制作用被HMGA2無3’非翻譯區(3’UTR)的開放閱讀框過度表達，癌基因HMGA2再次復活，結果是一些腫瘤通過染色體轉位消除癌基因3’UTR與Let-7靶點的結合。其他研究發現，Zhang等對227個癌標本，包括109個卵巢癌(93個原發腫瘤，16個癌細胞株)，73個乳腺癌(55個原發癌，18例細胞株)45個原發黑色素瘤原代細胞培養株，用高分辨aCHG檢測已知miRAN位于的基因區不正常的DNA拷貝數，癌組織和細胞株分別用Cy3、Cy5作標記，對照癌組織與細胞株熒光比值，DNA小于0.8為DNA丟失，大于1.2為增殖，針對每個miRNA基因所觀測到的DNA拷貝數大于15％的腫瘤中有顯著的更迭，37.1％(105/283)卵巢癌的miRNA基因位于DNA數不正常的基因區，乳腺癌為72.8％(206/283)，黑色素瘤為85.9％(243/283)，并發現hsa-miR-129在乳腺癌、卵巢癌和黑色素瘤中呈高表達。我們將經病理證實的7例膀胱移行細胞癌腫瘤組織標本及癌遠端正常對照組織，采用miRNA芯片檢測472條miRNA，發現7例腫瘤組織與正常組織存在大量差異miRNA，其中表達上調61條，表達下調68條，其中在5例以上患者表達均有差異的14條，Hsa-miR-129是上調表達的miRNA之一。

人小RNA?129(hsa-miR-129)的序列為5-cuuuuugcggucugggcuugc-25，僅有21nt，無法利用傳統的RT-PCR方法進行檢測，目前檢測hsa-miR-129表達方法主要依靠克隆、northern?blotting和引物延伸法等方法，但上述方法不僅操作復雜，技術要求高，而且價格昂貴，費時費力，且不能進行定量。雖然芯片方法能夠高通量檢測microRNA(miRNA)表達譜，但其靈敏度及特異性限制了該方法對hsa-miR-129的定量檢測；一些研究采用隨機引物進行RT-PCR檢測前體miRNA，但并不適用于成熟的hsa-miR-129檢測。實時熒光定量PCR是定量檢測基因表達的金標準。但由于hsa-miR-129長度僅為21nt，因此很難設計普通PCR檢測hsa-miR-129。

發明內容