[發明專利]利用分子標記輔助選擇快速轉育青花菜不育系的方法

無效

• 申請號: 200710067888.0
• 申請日: 2007-03-30
• 公開（公告）號: CN101057554A
• 公開（公告）日: 2007-10-24
• 發明（設計）人: 盧鋼;朱祝軍;鄒宜靜;邵泰良;何勇
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: A01H1/02
• 分類號: A01H1/02;A01H1/04;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司
• 代理人: 張法高

技術領域

本發明屬于雜種優勢利用領域，具體地說，本發明涉及一種青花菜胞質雄性不育系的選育技術，特別是一種利用分子標記輔助選擇快速培育青花菜雄性不育系的方法。

技術背景

青花菜，隸屬十字花科(Cruciferae)蕓薹屬甘藍種中以綠或紫色花球為產品的一個變種，一、二年生草本植物。學名：Brassica?oleracea?L.var.italica?Planch.染色體數2n＝2x＝18。青花菜富含維生素C、維生素B1、B2、B5等，并含有抗癌物質，因而深受國內外消費者的歡迎。青花菜是由甘藍演化而來，演化中心為地中海東部沿岸地區。在我國栽培歷史很短，但發展很快，在我國已經成為一些地區出口創匯的重要蔬菜。八十年代，我國開始引進了一些國外青花菜品種；九十年代，青花菜種植面積快速增長，但國內青花菜育種遠遠落后于十字花科其他種類。目前我國的育種主要以提純復壯、系統選育的傳統育種方法為主。生產上應用的品種90％以上依賴進口，生產上亟待培育有自主知識產權的優良品種。

青花菜是典型的異花授粉作物，品種或自交系間的一代雜種存在明顯的雜種優勢。目前雜交品種多采用自交不親和系，但是由于親本繁殖困難，有時會因多代自交后自交系生活力下降，而且易受環境影響，很難保證100％的雜交率。雄性不育系是青花菜生產一代雜種的理想系統。因此，青花菜雄性不育系的選育及其應用研究深受重視。選育并利用雄性不育系生產一代種子，可簡化制種手續，節省成本，并能確保一代雜種的種子純度。青花菜胞質雄性不育系繁制一代雜交種子，其生產成本為自交不親系的80％左右，雜交種子的雜交率可達到100％，不需要進行雜交種的純度鑒定，從而節省時間，有利于雜交種子的銷售。但是國內青花菜雄性不育系的選育起步較晚，對雄性不育遺傳規律的認識還停留在形態學和細胞學水平，產生雄性不育的分子機理還不清楚，國內青花菜種質資源較為缺乏而且遺傳背景狹窄，國外引進的雄性不育系均為雜種F1代，選育可供生產上利用的不育系還需要通過轉育、選擇配合力測定等一系列工作，轉育周期很長，限制了雄性不育系在生產上的進一步應用。

分子標記方法是實現作物快速、高效育種的手段。它不受環境因素變化的影響，結果可靠，其技術的核心是獲得與育種目標性狀緊密連鎖的分子標記，通過PCR技術實現其輔助育種的目標。目前已獲得了不少與青花菜質量性狀緊密連鎖的分子標記，并得到了廣泛應用。但同青花菜不育系和保持系特異連鎖的分子標記尚未見報道。所以本發明在鑒定分離青花菜不育系或保持系緊密連鎖的分子標記基礎上，建立分子標記輔助選擇方法快速轉育青花菜雄性不育系的方法。由于利用青花菜胞質雄性不育系繁制雜交種子節約成本，可降低雜交新品種種子價格，因而有利于新品種的迅速推廣，能夠使新品種更快發揮出巨大的社會效益。

發明內容

本發明的目的是針對目前青花菜雜交種常規制種成本高、雜交種子主要依賴進口、價格昂貴且純度及種源難以保證這一現狀，提出一種利用分子標記輔助選擇快速轉育青花菜胞質雄性不育系的方法。

本發明為達到以上目的，是通過這樣的技術方案來實現的，包括以下步驟：

1.選擇青花菜胞質雄性不育雜合體為母本，以優良的青花菜自交系為輪回親本，進行常規有性雜交，所得的雜種一代F1再與輪回親本回交，得到回交一代BC1F1分離群體，種植于田間；

2.利用與雄性不育連鎖的特異分子標記，其具序列1，序列2的特征；采用聚合酶鏈式反應PCR檢測并對上述植株苗期選擇含目標基因的單株；

3.利用與優良保持系具有緊密連鎖性的特異SCAR和AFLP標記對上述單株遺傳背景實施選擇，選出輪回親本遺傳背景最多的單株；

4.選取上述入選單株，待開花時以此為母本，以輪回親本為父本，進行回交，得到回交二代BC2F1；成熟后，選取若干個綜合性狀好的套袋單株進行收種并種植；

5.然后重復步驟2)至步驟4)，通過3-4代的回交就能獲得不育性穩定的，純度較高的青花菜不育系，輪回親本即為相應的保持系。

所述采用聚合酶鏈式反應PCR檢測方法包括以下步驟：

1)植株的基因組DNA的提??；

2)以序列1(5’-TGC?ATTGTCTAGAAGTGGTGA)和和序列2(5’-GAAGAATGAAAAGTGGAATGG)所述的核苷酸分子為引物，對上述基因組DNA進行PCR擴增；

3)對PCR擴增產物進行凝膠電泳，凡呈現DNA條帶的樣品記錄即為陽性樣品。

所述利用AFLP分子標記篩選遺傳背景的方法包括以下步驟：