[發明專利]一種高活性雞溶菌酶的基因克隆、表達與應用

有效

• 申請號: 200710067728.6
• 申請日: 2007-03-20
• 公開（公告）號: CN101050467A
• 公開（公告）日: 2007-10-10
• 發明（設計）人: 黃繼榮;傅正偉;李浙烽;余榮
• 申請（專利權）人: 李浙烽
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N15/79;C12N9/36;A23K1/165
• 代理公司: 杭州九洲專利事務所有限公司
• 代理人: 陳繼亮

技術領域

本發明屬于分子生物學制藥技術領域，是一種高活性雞溶菌酶的基因克隆、表達與應用，基因工程重組方法生產雞溶菌酶的方法。

背景技術

溶菌酶主要存在于動植物的組織液和某些微生物體內，如鼻粘液、眼淚、唾液、卵蛋白、枯草桿菌培養物和某些蔬菜中。該酶能水解細菌的細胞壁中N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4-糖苷鍵，故又稱胞壁質酶，即N-乙酰胞壁質糖苷聚糖水解酶。

其中對雞蛋清溶菌酶的研究最清楚，它是由129個氨基酸殘基構成的一種堿性蛋白，分子量約為14KD，對熱穩定，對堿不穩定，對革蘭氏陽性細菌有較強的殺菌作用。可藥用，具抗菌、清除局部壞死組織、止血、消腫、消炎等作用。在食品工業上可用作防腐劑，還可添加在牙膏中作為防治齲齒的藥用牙膏。在發酵工業上是一種重要的溶菌劑，用于分解細胞壁，制備無菌體提取液。

目前，從雞蛋清提取溶菌酶以及從霉菌中提取溶菌酶均已達工業化生產水平，市場銷售的溶菌酶大多來源于雞蛋蛋清中工業化提取的，價格較高。但隨著國內外需求量的增大，市場上溶菌酶供不應求；同時溶菌酶的生產也受到原材料的限制，無法滿足市場上溶菌酶的需求。因此，提高溶菌酶的產量與活性是一個急需解決的重要問題。

發明內容

本發明的目的正是為了克服上述技術的不足，而提供了一種高活性雞溶菌酶的基因克隆、表達與應用，通過發酵大批量生產溶菌酶的方法，本方法生產的溶菌酶是在篩選多種雞蛋溶菌酶的基礎上，獲得了高生物活性、高表達的溶菌酶基因。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案。這種DNA分子，它編碼具有雞溶菌酶蛋白活性的多肽核苷酸序列，多肽核苷酸序列如附圖1所示，載體含有上述的DNA序列。本發明采用真核表達載體pPIC6αA、pGAPZαA與畢赤酵母宿主菌X-33進行重組雞蛋清溶菌酶的表達。

本發明的解決方法是分離獲得一種具有高活性的雞蛋溶菌酶基因，經過PCR擴增、酶切等操作后，克隆到真核表達載體中，并轉化整合到畢赤酵母基因組內進行表達，然后提取、純化出高活性雞蛋清溶菌酶。

這種生產基因工程雞溶菌酶的方法，具體步驟如下：

(a)、將篩選獲得的LYS蛋白質的核苷酸序列可操作性的連接于表達調控序列，形成LYS表達載體，所述的核苷酸編碼一多肽，所述的多肽具有溶菌酶活性；

(b)、將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成表達LYS蛋白的重組細胞；

(c)、在適合表達LYS多肽的條件下，培養、表達步驟(b)中的重組細胞；

(d)、分離純化出LYS蛋白。

本發明蛋白表達方法中的提取工藝為：工程菌種接種于BMGY培養基中，28℃，300rpm條件下搖床振蕩培養36小時，離心收集菌體；重新懸浮、接種于含BMMY培養基的發酵罐中，流加100％甲醇誘導表達，控制溶氧度在30％以上，28℃條件下發酵100h，離心收集上清液，透析去離子，經過陽離子交換樹脂層析柱，連續洗脫留取活性峰液，再透析去離子，經活性鑒定后分裝凍干，即為成品。

雞蛋溶菌酶作為飼料添加劑的應用，其使用方法為：按重量百分比計，溶菌酶添加量為10000～100000U/kg。

本發明有益的效果：由于采用基因工程重組技術，發酵生產基因重組雞蛋清溶菌酶，能夠較大批量的生產基因工程修飾的雞蛋清溶菌酶，不受原材料來源的限制，顯著提高溶菌酶的產量。其產品具有穩定、純凈、生物活性高的特點。

附圖說明

附圖1是本發明多肽核苷酸序列示意圖；

附圖2雞蛋殼提取溶菌酶抑菌試驗與Weatem-Blot分析結果

附圖3?pIC6αA-mLYS單拷貝表達載體構建策略

附圖4?pPIC6αA-mLYS多拷貝表達載體構建策略

附圖5?pGAPZαA-mLYS單拷貝表達載體構建策略

附圖6?pGAPZαA-mLYS多拷貝表達載體構建策略

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步描述。

一、獲取雞蛋溶菌酶基因

1雞蛋清溶菌酶的提取工藝

將購買自全國各地的56種地方品種來源的雞蛋作為原料提取雞蛋清溶菌酶，工藝如下：

1.1配制蛋清液純蛋清中加入適量去離子水，攪拌混勻，過濾，測濃度，備用。

1.2樹脂吸附向制備的蛋清液中加入已經充分平衡后的陽離子吸附樹脂，慢速攪拌，以樹脂在液體中充分運動無死角為宜。室溫下吸附2～3h，然后過濾將樹脂蛋清分離，對樹脂進行洗脫。