[發(fā)明專利]一種通路克隆入門載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710066422.9
• 申請日: 2007-12-05
• 公開（公告）號: CN101302530A
• 公開（公告）日: 2008-11-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳麗梅;李昆志;馬莉;宋中邦;胡清泉
• 申請（專利權(quán)）人: 昆明理工大學(xué)
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/65;C12N15/82
• 代理公司: 昆明今威專利代理有限公司
• 代理人: 賽曉剛;邱苡

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種通路克隆(Gateway)技術(shù)的入門載體，特別是含有光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(PrbcS)和GFP的Gateway入門載體，本發(fā)明還涉及該入門載體的構(gòu)建及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件，在數(shù)量和質(zhì)量上調(diào)控基因的表達(dá)。植物基因工程中常用的啟動(dòng)子按其作用方式及功能可分為組成型啟動(dòng)子和器官特異型啟動(dòng)子。在植物轉(zhuǎn)基因操作中，最常用的一種啟動(dòng)子是來自花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動(dòng)子，這種啟動(dòng)子在植株被CaMV感染期間，指導(dǎo)35S?RNA合成，在植物的很多組織中都能高效表達(dá)(Odell等，1985；Nature，313：810-812)，大多數(shù)的研究認(rèn)為CaMV35S在植物中的表達(dá)模式為組成型，它不需要任何誘導(dǎo)作用，也沒有很強(qiáng)的器官組織特異性，用CaMV35S驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)產(chǎn)生的目標(biāo)蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中，因此CaMV35S是組成型啟動(dòng)子，目前商業(yè)化能提供的植物表達(dá)載體都是含有CaMV35S啟動(dòng)子的質(zhì)粒。用報(bào)告基因的研究結(jié)果表明CaMV35S的表達(dá)在根中最強(qiáng)，在莖、葉片、花和果實(shí)中較弱(Jefferson等，1987；EMBO，6：3901-3907)，因此要用CaMV35S實(shí)現(xiàn)目的基因在植物地上部分的器官如葉片中高水平表達(dá)同時(shí)使所表達(dá)的目的蛋白定位到細(xì)胞器如葉綠體中是不可能的。

1，5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)是植物中表達(dá)量最大的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)的含量占植物細(xì)胞中可溶性蛋白的40-50％。Rubisco的小亞基(rbcS)由細(xì)胞核基因編碼，控制rbcS基因表達(dá)的啟動(dòng)子為光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(PrbcS)，在PrbcS的5’上游調(diào)控區(qū)有光應(yīng)答元件，此外在該啟動(dòng)子中還有將rbcS定位到葉綠體基質(zhì)的信號肽序列，PrbcS的表達(dá)有很強(qiáng)的組織特異性，需要光信號的誘導(dǎo)，在莖中有低水平的表達(dá)，在葉片中的表達(dá)最強(qiáng)(Sugita?et?al.，1987，MGG，209：247-256)。用報(bào)告基因的研究結(jié)果表明在葉片中PrbcS的活性比CaMV35S的高3-4倍，因此PrbcS是一種很強(qiáng)的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Jefferson等，1987；EMBO，6：3901-3907)，在科研工作中PrbcS常被用來實(shí)現(xiàn)目的基因在葉片中的高水平表達(dá)和目的蛋白在葉綠體中的定位。

Invitrogen公司根據(jù)λ噬菌體基因組和大腸桿菌基因組之間的位點(diǎn)專一性重組的分子機(jī)制開發(fā)了一套分子克隆新技術(shù)，即通路克隆(Gateway)技術(shù)，Gateway技術(shù)的BP反應(yīng)體系是根據(jù)λ噬菌體基因組和大腸桿菌基因組之間的整合機(jī)制設(shè)計(jì)出來的，BP反應(yīng)是利用PCR產(chǎn)物產(chǎn)生Gateway的入門克隆方法之一。Gateway技術(shù)的LR反應(yīng)體系是根據(jù)λ噬菌體基因組從大腸桿菌的基因組中切離的機(jī)制設(shè)計(jì)出來的，利用Gateway的LR反應(yīng)可以構(gòu)建目的基因的表達(dá)載體。利用限制性內(nèi)酶和連接酶構(gòu)建質(zhì)粒載體時(shí)需要對DNA進(jìn)行切割并回收目標(biāo)片斷，然后用連接酶連接，這是一種費(fèi)時(shí)間又費(fèi)錢的工作。由于連接產(chǎn)物中被連接成功的質(zhì)粒含量不高，因此要求用于轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物的感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率非常高，才能獲得目的基因的克隆。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化操作使用的表達(dá)載體都是分子量很大的質(zhì)粒載體，用大分子量的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞時(shí)轉(zhuǎn)化效率會(huì)降低很多，因此用限制性內(nèi)酶和連接酶構(gòu)建大的質(zhì)粒載體時(shí)，即使感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率非常高，成功的幾率還是很低的。用Gateway技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒載體時(shí)不需要利用限制性內(nèi)酶和連接酶，它只需要把兩種質(zhì)粒DNA混合并加入DNA整合或切離所需要的蛋白質(zhì)就能完成新質(zhì)粒的構(gòu)建，因此可以節(jié)省很多時(shí)間。但是目前Invitrogen公司開發(fā)的Gateway技術(shù)體系中沒有植物表達(dá)載體，而比利時(shí)的VIB/Gent公司開發(fā)的Gateway植物表達(dá)載體用的啟動(dòng)子都是CaMV35S，這就極大地限制了Gateway技術(shù)在植物基因工程操作中的應(yīng)用。葉片是植物的光合作用器官，在葉綠體中有很多的代謝途徑，如果要使目的基因在葉片中獲得高水平表達(dá)，用PrbcS控制目的基因的表達(dá)往往會(huì)獲得理想的結(jié)果。利用Gateway的BP反應(yīng)可以產(chǎn)生Gateway的入門克隆，但是在實(shí)踐操作中本申請人發(fā)現(xiàn)使用這種技術(shù)操作的PCR產(chǎn)物片斷較大時(shí)成功的幾率不高。Invitrogen公司還開發(fā)了另外兩種產(chǎn)生Gateway入門克隆的方法，其中之一是TOPO克隆技術(shù)，但是這種技術(shù)的成本較高，如果PCR產(chǎn)物片斷較大時(shí)成功的機(jī)率也不高。

發(fā)明內(nèi)容：