[發明專利]一種STR位點重復次數測定方法

無效

• 申請號: 200710066291.4
• 申請日: 2007-10-18
• 公開（公告）號: CN101168770A
• 公開（公告）日: 2008-04-30
• 發明（設計）人: 譚德勇;余敏;馬明星
• 申請（專利權）人: 昆明云大生化科技有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N27/447
• 代理公司: 昆明正原專利代理有限責任公司
• 代理人: 楊宏珍

技術領域：

本發明為一種STR位點重復次數測定方法，屬于生物技術領域。特別適用于基因身份證的制作。

背景技術：

短串聯重復序列(short?tandem?repeat，STR)普遍存在于高等真核生物的基因組中，同一個STR位點在不同的個體之間存在差異，這種差異叫多態性，由于這種多態性是可遺傳的，因此它是每個生物個體的生物學特征，它不隨發育時間和組織部位的差異而改變，因此廣泛應用于生物個體的識別。每個STR位點有幾種到幾十種多態性，選擇多個不同的STR位點，各個位點的多態性的組合可以區分任何兩個“非同一克隆個體”，因此可用這種技術制作生物的基因“指紋”。目前，在法醫上被廣泛應用，是目前法醫上最有效的個體識別方法。

STR分析過程是根據STR位點兩端的DNA序列設計PCR引物，PCR產物為包含STR位點全部重復序列的DNA片段，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析其產物的大小。由于不同的基因型表現為重復次數的差異，根據PCR產物大小是否不同可以判斷是否為相同的基因型，因此能判斷STR片段大小是STR分析的關鍵。

目前，法醫上使用的人STR分析技術基本都采用ABI公司的ABI?AmpFlSTRIdentifiler^TM技術。即將STR位點分成幾個不同的組，不同的組標記不同的顏色的熒光，每個組的不同位點通過其PCR產物的大小區分；所有STR位點在一個反應管中進行PCR擴增，擴增產物泳測序膠，然后用測序儀進行分析。這一技術體系可以測定STR的重復次數，但存在以下不足：1.設備和試劑昂貴，每一人份的測試費用近800元，甚至更高；2.增加更多的位點數比較困難，因為目前的熒光顏色種類有限，每個組的空間有限，增加位點有困難，同時位點數增加，檢測過程中的PCR擴增難度增加。由于上述原因，這一技術只能應用在法醫的案件偵破等中應用，而在其它方面的應用，比如人基因身份證的制作方面就難以推廣普及。

STR分析的關鍵是解決PCR產物大小測定問題。采用常規的電泳方法不能測定PCR產物大小的原因是：STR的PCR產物較大，多數為200-400bp，當兩個樣本之間的PCR產物只相差一個重復(3-6個堿基)時，常規電泳難以分辨；另一問題是需要有精確測定PCR產物大小的分子量標準。

經過文獻檢索，未見與本發明相同的公開報道。

發明內容：

本發明的目的在于克服現有技術之不足，而提供一種既簡便，又成本低的STR位點重復次數測定方法。

本發明內容包括：

1.STR位點的選擇和PCR引物設計原則。選用重復單位為4bp，并且不具有不完全重復等位基因的STR位點作為檢測位點。設計PCR引物使之產物的大小為4的倍數，同時在160bp以下。選擇4bp重復的理由在于：多數STR位點的重復單位都為4bp重復，或是更小的重復單位，如3bp和2bp重復在STR分析中難以分辨。在STR位點中，有的存在非等倍重復的等位基因，即是2個等為基因之間的差別不是完整的重復單位，因此，PCR產物大小的差異小余4堿基，這樣的位點在本發明的技術體系中對判斷其PCR產物大小帶來困難。本發明避免采用這種STR位點。STR分析的引物設計同時要使得其PCR產物小余160bp，這是因為本發明采用的是常規聚丙烯酰胺凝膠電泳，對200bp以上的DNA片段的分辨較差，為提高分辨率，PCR產物控制在160bp以下。PCR引物設計中還要控制PCR產物的大小為4的倍數，這是為了與測定PCR產物大小的DNA?Ladder配合。

2.用間隔為8bp的DNA?Ladder作為分子量測定標準。由于選擇4bp的重復單位，而引物設計時使得其PCR產物是4的倍數，這樣STR產物與間隔為8bp的DNA?Ladder比較，要么與DNA?Ladder的條帶在同一個位置，根據DNALadder直接讀出STR片段的大小；要么落在DNA?Ladder的兩條帶之間，用STR片段臨近的DNA?Ladder條帶的堿基數加4bp即為STR片段的堿基數。這樣，就能很精確地判斷STR片段的大小，然后計算出STR的重復次數。

3.采用常規的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離STR的PCR產物。由于STR的PCR產物的大小相差為4bp，DNA?Ladder的差距為8bp，采用普通的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳就能有效地分辨STR的DNA?Ladder和PCR產物。由于非變性膠電泳中，雙鏈DNA的遷移率與堿基組成關系不大，僅僅與分子大小(堿基多少)有關。因此用一套DNA?Ladder對任何STR位點的分析都適用。

本發明的優點在于：