[發(fā)明專利]一種快速提取植物根際土中AM真菌環(huán)境DNA的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710066211.5
• 申請日: 2007-09-19
• 公開（公告）號: CN101148677A
• 公開（公告）日: 2008-03-26
• 發(fā)明（設計）人: 李濤;趙之偉
• 申請（專利權）人: 云南大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/10
• 代理公司: 昆明正原專利代理有限責任公司
• 代理人: 楊宏珍

技術領域：

本發(fā)明涉及一種快速提取植物根際土中AM真菌環(huán)境DNA的方法，屬于分子生物學和應用微生物學領域。

背景技術：

叢枝菌根真菌(Arbuscular?Mycorrhizal?Fungus，AMF)是自然界中一類分布廣泛的土壤微生物，它可以與約90％以上的陸生維管束植物的根系形成一種互惠共生體——叢枝菌根(Arbuscular?Mycorrhiza，AM)。越來越多的研究表明根際土中大量的AMF根外菌絲在土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的生態(tài)學功能，發(fā)現(xiàn)土壤中AMF的種類和組成已成為影響植物群落定居、演替、植物區(qū)系組成的一個重要因素，進而也是影響生態(tài)系統(tǒng)中資源配置、生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性、物種多樣性和生產力的重要因素。叢枝菌根表現(xiàn)出可以在不同組織水平上(Hierarchical?Organizational?Levels)影響生命系統(tǒng)的過程和功能。因此，AM已成為生態(tài)系統(tǒng)中一個重要的功能類群。基于菌根的古老起源及其分布的普遍性、生態(tài)功能的多樣性和重要性，球囊霉門真菌國際菌種庫(The?International?Bank?for?the?Glomeromycota，BEG)管理委員會提出“嚴格地講，自然界中的多數(shù)植物沒有傳統(tǒng)意義上的根系，只有菌根。因此，有關植物的研究如果不考慮菌根或者菌根的影響就不能全面反映植物生長的真實情況”。

因此，開展AMF群落結構特征及其生態(tài)分布調查研究一直是AM研究領域的一個熱點。然而，由于AM真菌絕對活體營養(yǎng)這一生物學特性使得目前還無法對其進行傳統(tǒng)意義上的純培養(yǎng)，AM真菌這一特性極大地阻礙了AM真菌群落生態(tài)學的調查研究。自Simon等1992年首次報道了用特定的PCR引物對AMF的18S核糖體基因進行擴增得到AM真菌的第一條DNA序列以來，分子生物學這一有力工具在菌根研究領域初步顯現(xiàn)出獨特的魅力。因此，如何有效、快捷地從根際土或少量的新鮮根樣中獲得一定量的AM真菌目的DNA是開展AM真菌分子生態(tài)學及其應用研究的核心問題。

目前，從根際土(或植物根樣)中獲得AM真菌目的DNA的方法主要包括CTAB法、Chelex-100樹脂法以及DNA提取試劑盒等。然而，以上三種方法都不能完全有效地解決從混有大量雜質的根際土中獲得一定純度的、有代表性的DNA。因此，從適量的根際土中獲得AMF環(huán)境DNA對開展AMF分子生態(tài)分布特點研究顯得尤為重要。

經文獻檢索，未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明內容相同文獻的公開報道。

發(fā)明內容：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術之不足，通過發(fā)明一種快速提取植物根際土中AM真菌環(huán)境DNA方法，迅速擴增根際土中AM真菌目的DNA片段，從分子生態(tài)學層面上更準確、全面地了解AM真菌在根際土中的生態(tài)學地位和功能。

本發(fā)明利用根際土中AMF相關結構可以懸浮在水面的特點，結合CTAB法和Chelex-100樹脂(Chelex-100resin，以亞氨二乙酸為吸附的苯乙烯與二乙基苯的共聚物)方法并加以改進，解決了從大量的(100g或更多)根際土樣品中獲得AM真菌環(huán)境DNA的問題。

土壤中存在許多影響PCR效率的制約因子，如何有效去除這些制約因子是開展土壤生物分子生物學研究的首要問題。本發(fā)明根據(jù)根際土中AM真菌通常可以形成較大的厚垣孢子且能懸浮在水表面的特性，采用濕篩沉淀法初步去除土壤中大部分PCR制約因子，收集根際土壤中AM真菌相關結構(如AMF厚垣孢子、AMF根外菌絲等)作為提取AM真菌環(huán)境DNA的樣品，從而有效解決市售試劑盒只能從痕量樣品提取DNA而缺乏代表性的不足(如美國EPICENTRE?SoilMaster提取試劑盒，只能提取0.10g土壤)。通過濕篩傾析法收集到AMF孢子等結構經過CTAB試劑提取后，一方面，CTAB促進DNA的釋放并減少機械破壁過程中如內源核酸酶對目的DNA的降解作用；另一方面，利用首輪有機溶劑(如等體積苯酚和氯仿混合液)初步去除大部分有機雜質，然后用Chelex-100樹脂代替CTAB法中后續(xù)的多次有機溶劑的純化過程。聯(lián)合應用Chelex-100法及CTAB法可以有效地減少CTAB法在多輪有機試劑純化過程中造成目的DNA片段損失。同時，由于CTAB法的引入可以促進目的DNA分子從大量樣品中釋放，并經過首輪有機試劑純化后去除溶液中大量的蛋白質、脂肪等雜質。然后利用Chelex-100樹脂對多價金屬離子的整合作用，可防止DNA在煮沸加熱時被降解，同時在高溫低離子強度下還有催化DNA釋放的作用，這樣既可以減少DNA的損失，又可以消除擴增中的一些抑制因子。