[發(fā)明專利]食線蟲芽孢桿菌胞外侵染性中性蛋白酶基因及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710065912.7
• 申請日: 2007-05-29
• 公開（公告）號: CN101113455A
• 公開（公告）日: 2008-01-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃曉瑋;張克勤;牛秋紅
• 申請（專利權(quán)）人: 云南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/57
• 分類號: C12N15/57;C12N9/54;C12N1/21
• 代理公司: 昆明正原專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 楊宏珍

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種食線蟲芽孢桿菌胞外侵染性中性蛋白酶基因及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

植物寄生線蟲具有地域分布廣泛、宿主種類多樣等特征，并容易使已發(fā)生線蟲病害的植物繼發(fā)真菌或細(xì)菌感染，從而給農(nóng)作物、林木和食用菌帶來很大的危害。而我們現(xiàn)今所依賴的化學(xué)防治，由于對環(huán)境的破壞以及對人畜安全性的影響，其使用正逐步受到限制，因此生物防治病原線蟲成了植物線蟲病害綜合治理研究的前言和熱點。在線蟲侵染過程中，無論是對于蟲體本身還是線蟲蟲卵來說，其覆蓋于表面的體壁或卵殼都是線蟲防止侵染的重要保護結(jié)構(gòu)，而蛋白酶能有效地降解線蟲體壁，協(xié)助殺線蟲生物完成侵染過程，是線蟲侵染的重要毒力因子之一，但目前從殺線蟲細(xì)菌中獲得的可降解線蟲體壁的蛋白酶基因非常有限。因此在食線蟲細(xì)菌的研究中，新的可降解線蟲體壁的中性蛋白酶基因發(fā)現(xiàn)，克隆及其功能研究，不僅能進一步完善食線蟲細(xì)菌侵染線蟲的分子機理，并可促進線蟲生防研究向基因工程方向發(fā)展，為線蟲生防菌的遺傳改良及將侵染性蛋白酶基因轉(zhuǎn)入農(nóng)作物構(gòu)建培育出抗性品種奠定重要基礎(chǔ)。

經(jīng)文獻檢索，未見與本發(fā)明相同的公開報道

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的在于提供一種食線蟲芽孢桿菌胞外侵染性中性蛋白酶基因及其應(yīng)用。

本發(fā)明人在開展殺線蟲細(xì)菌研究中，獲得一株對線蟲具有強侵染作用的食線蟲細(xì)菌新種Bacillus?nematocidus?B16，Bacillus?nematocidus?B16，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址：中國.北京.中關(guān)村；保藏日期：2004年4月5日；保藏號：CGMCC?No.1128。

本發(fā)明通過分離純化、性質(zhì)鑒定、兼并引物設(shè)計等技術(shù)，在該芽孢桿菌屬的細(xì)菌中克隆出了一種新的可降解線蟲體壁、且具殺線蟲活性的中性蛋白酶基因，提交GenBank，序列號為：AY708654。編碼胞外侵染性中性蛋白酶的開放性閱讀框架長1566bp，共編碼521個氨基酸殘基。其中含有27個氨基酸殘基的信號肽，194個氨基酸殘基的前肽，成熟肽具有300個氨基酸殘基。

本發(fā)明利用pET30載體系統(tǒng)在大腸桿菌宿主細(xì)胞BL21中得到成功異源表達，重組蛋白大部分是以包涵體形式存在。經(jīng)鎳離子親和層析柱純化、SDS-PAGE電泳分析顯示，重組蛋白分子量為42kD，經(jīng)過復(fù)性后其活性達到原來的76.05％，該重組蛋白酶對線蟲Panagrellus.redivius的半致死率為1.70μg?ml^-124h^-1，對線蟲Bursaphelenchusxylophilus的半致死率為2.28μg?ml^-124h^-1。同時利用該蛋白酶處理純化的線蟲體壁，在解剖顯微鏡下觀察到大量的不完整的線蟲體壁碎片，證實胞外侵染性中性蛋白酶對線蟲體壁的降解作用以及殺線蟲活性。

本發(fā)明通過分析驗證實驗，證實來源于殺線蟲芽胞桿菌的胞外侵染性中性蛋白酶基因及其編碼產(chǎn)物能有效降解線蟲體壁、并具有殺線蟲活性。故該基因用來研究蛋白酶在侵染線蟲過程中的生化本質(zhì)，并作為獲得高效生防菌株的靶基因。

附表胞外中性蛋白酶純化過程中各酶液及異源表達重組蛋白的酶活和對線蟲的毒殺作用