[發明專利]一種規模化獲得十字花科作物小孢子植株的方法

無效

• 申請號: 200710065867.5
• 申請日: 2007-05-11
• 公開（公告）號: CN101049081A
• 公開（公告）日: 2007-10-10
• 發明（設計）人: 王敬喬;陳葦;劉麗;董云松;李根澤
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院經濟作物研究所
• 主分類號: A01H1/00
• 分類號: A01H1/00;A01H4/00
• 代理公司: 昆明正原專利代理有限責任公司
• 代理人: 賽曉剛

技術領域：本發明為一種獲得十字花科作物小孢子植株的方法，特別涉及小孢子培養單倍體、雙單倍體植株的規模化生產。屬于生物學領域。

背景技術：小孢子培養是指直接從花蕾或花藥中獲得游離的、新鮮的小孢子群體而進行培養的方法。通過小孢子培養，在不進行人工染色體加倍的情況下，可以獲得單倍體植株；這一獲得單倍體植株的方法可用于誘變篩選、抗源創造、胚胎發生機理、遺傳分析、基因定位等方面的研究。同時，小孢子培養也可以通過人工染色體加倍(或自然加倍)，獲得基因型純合的雙單倍體；所以，利用這種小孢子培養方法，無需對雜交育種進行多代自交，只需利用這種雙單倍體植株的種子在田間種植能產生性狀穩定一致的純系(DH系)，特別適用于難以穩定性狀的純合。同時，應用這一技術可使育種時間大為縮短，育種進程迅速加快。另外，利用小孢子培養獲得的DH群體，還是遺傳分析及分子標記遺傳圖譜研究的理想材料。因此，小孢子培養技術正受到從事遺傳、育種、生理、病理等方面工作者的高度重視。

自從Liehter對甘藍型油菜小孢子培養獲得成功后，該技術經過十幾年的發展和完善，小孢子再生胚的頻率有了很大的提高。加拿大和西歐國家的科學家對影響小孢子胚胎發生的很多因素進行了較為詳盡的研究。結果證明，小孢子供體植株的生理狀態是影響其胚狀體發生的重要因素之一。為使供體植株不受逆境沖擊，提高小孢子培養效率，國外一般將供體植株種在光照時間、強度和溫度、濕度均自動控制的現代化人工氣候室中，供體植株受外界環境影響小，從而使小孢子發育較為一致，小孢子再生胚的數量穩定。同時，由小孢子胚狀體生產的試管苗也是通過移栽到人工氣候室或大型溫室，具備了一年四季均能進行小孢子培養及植株再生能力，但小孢子植株的生產成本仍然較高。

在國內，對甘藍型油菜小孢子培養研究起步較晚。直到1990年，鐘維瑾等首次對大田甘藍型油菜小孢子進行培養并獲得單倍體植株。但是，該技術在育種中應用的規模和效率遠比國外低，其原因是國內沒有(或費用太高)能控溫的一年四季均可種油菜的大型氣候室和現代化設施，小孢子培養的難度較大。主要問題集中表現為三個方面：1)小孢子胚狀體誘導頻率較低，受所配制組合親本的基因型影響顯著，某些材料甚至不能得到胚狀體；2)胚狀體(或胚)的成苗技術尚不成熟，胚狀體直接成苗率不高(20％左右)，一般要經多次繼代培養至6-7月份形成小植株；3)當小孢子植株形成時，我國主要冬油菜區正值夏季，小植株不能及時移栽于田間，仍需保存在培養室中繼代培養4-5個月，不但需要耗費額外的人力、物力及財力，限制了試驗規模，延緩了育種進程，而長期繼代培養易發生體細胞變異。針對這一問題，雖開展了一些研究，如在培養基中加入多效唑延緩小苗生長，或低溫保存胚狀體或小苗，但均未取得良好的效果。因此，如何有效地解決這一問題，是小孢子培養技術在我國冬油菜遺傳育種中有效應用的一個至關重要的技術問題。

本專利方法可高效率地獲得小孢子胚；通過小孢子胚的成熟培養，可極大地提高其萌發與植株再生頻率；通過本專利方法生產的小孢子胚還可在非嚴格要求的條件下萌發與再生，可大大節約小孢子植株的生產成本。因此，本專利方法特別適用于小孢子植株的規模化生產。

發明內容：本發明針對制約小孢子培養技術在我國相關領域規模化應用的主要問題——小孢子胚的萌發、植株再生的效率與生產成本，發明一種可以通過小孢子幼胚的進一步培養大大提高小孢子的萌發與植株再生效率，通過較為粗放的常規有菌(非無菌)條件下的小孢子萌發與植株再生，降低小孢子植株規模化生產成本的獲得十字花科作物小孢子培養植株的方法。

本發明一種規模化獲得十字花科作物小孢子植株的方法，其特征在于：使小孢子培養胚充分成熟，同時在非無菌條件下進行小孢子胚的萌發與再生，獲得小孢子培養植株，該方法包括以下內容、步驟和結果：

(1)小孢子的分離；

(2)小孢子的培養；

(3)小孢子幼胚的成熟培養；

(4)小孢子成熟胚的萌發與再生方法；

(5)成熟胚的再生頻率為20％至100％。