[發明專利]植物內生菌的制備方法

無效

• 申請號: 200710065724.4
• 申請日: 2007-03-19
• 公開（公告）號: CN101050424A
• 公開（公告）日: 2007-10-10
• 發明（設計）人: 王浩鑫;曾英;沈月毛
• 申請（專利權）人: 中國科學院昆明植物研究所
• 主分類號: C12N1/00
• 分類號: C12N1/00
• 代理公司: 云南協立專利事務所
• 代理人: 謝嘉

所屬領域：

本發明涉及一種從植物材料中富集內生微生物的方 法，也就是涉及一種植物內生菌的制備方法。

背景技術：

植物個體無論是一粒種子還是一棵參天大樹，都是一 種相對復雜的生態環境，種類和豐度不同的微生物棲息其中；對于生 活在活的植物組織內部而對植物不產生直接負面影響的微生物，被統 稱為植物內生菌。植物內生菌普遍存在于植物體而且種類繁多，除少 部分內生菌集中群居在植物的某些特定部位比如根瘤和冠癭瘤以外， 絕大多數植物內生菌通常在植物體內分散而居，人們對這些內生菌的 棲息部位和種類多樣性知之甚少。不僅如此，大部分環境微生物包括 為數眾多的植物內生菌難以人工培養成活，因而不能通過純培養進行 分離鑒定以及產物化學研究。為了運用內生菌宏基因組的研究策略發 掘植物內生菌的基因資源并開發其化合物產生的潛能，首要步驟是從 植物材料富集植物內生菌并去除大量植物遺傳物質的干擾。相關的報 道僅有富集土壤微生物的方法，其原理是通過密度梯度離心去除土壤 雜質，本發明人曾采用此種原理的方法卻不能從植物組織有效富集到 內生菌，這是因為所要去除的雜質存在本質不同，前者是土壤顆粒而 后者是植物遺傳物質。為了達到從植物材料富集內生菌的目的，本申 請的發明人在2006年曾報道用纖維素酶和離析酶從植物葉片和種子 富集內生菌的方法(Journal?of?Applied?Microbiology?100：830-837)。 后續研究發現該方法存在缺點，即酶作用時間較長，可能因某些微生 物的滋生而造成富集樣品內生菌豐度偏差。

發明內容：

本發明的目的是克服上述已有技術的局限，提供一種 新的植物內生菌制備方法。

為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案：

植物內生菌的制備方法，取植物材料經高速組織搗碎機勻漿，低 速離心200g×5min，取上清液加入鹵鹽氯化鈉或氯化鋰至終濃度 0.1％～3.0％，以重量/體積為單位，再加入表面活性劑十二烷基磺酸鈉 或Triton?X-100至終濃度0.01～2.0％，以重量/體積為單位，混勻，靜 置1-2小時，取上清液5000g離心10分鐘，得到沉淀為植物內生菌。

上述方法所使用的鹵鹽優選用一價陽離子鹵鹽，或二價陽離子鹵 鹽。

上述方法所使用的表面活性劑優選用離子型表面活性劑或非離 子型表面活性劑。

本發明的方法是基于一定量的植物材料和無菌水用高速組織搗 碎機處理，勻漿液經低速離心分離之后，用一定濃度的鹵鹽和表面活 性劑清除植物來源雜質包括細胞核、細胞器和膠質等，自然沉降后取 上清液經高速離心收集沉淀就可得到內生菌豐富而植物遺傳干擾物 質甚少的富集樣品。

具體實施方式：

下面結合本發明的實施例進一步來說明本發明的實質性內容，但 并不以此限定本發明。

實施例1：

取滑桃樹莖皮40克，用自來水和蒸餾水洗凈，加入300毫升無 菌水，用高速組織搗碎機18000rpm勻漿；用無菌紗布過濾去除未破 碎的組織與纖維，濾液用低速離心(200g×5min)分離去除沉淀；往 上清液中加入氯化鈉至終濃度1.0％(w/v)以及十二烷基磺酸鈉至終 濃度0.05％(w/v)，顛倒混勻并靜置1小時，此時會有大量絮狀沉淀 產生，不要擾動沉淀；小心吸取上清液至一新的滅菌離心管，5000g 離心10分鐘，得到的沉淀即為內生菌富集樣品。

實施例2：

取云南美登木新鮮葉片20克，用自來水和蒸餾水洗凈，加入400 毫升無菌水，用高速組織搗碎機15000rpm勻漿；用無菌紗布過濾去 除未破碎的組織與纖維，濾液用低速離心(200g×5min)分離沉淀； 往上清液中加入氯化鋰至終濃度0.6％(w/v)以及Triton?X-100至終 濃度0.15％(w/v)，顛倒混勻并靜置2小時，此時會有大量絮狀沉淀 產生，不要擾動沉淀；小心吸取上清液至一新的滅菌離心管，5000g 離心10分鐘，得到的沉淀即為內生菌富集樣品。

實施例3：