[發明專利]一種適于巰基標記的極性敏感熒光探針及其制備方法與應用

無效

• 申請號: 200710065564.3
• 申請日: 2007-04-16
• 公開（公告）號: CN101289446A
• 公開（公告）日: 2008-10-22
• 發明（設計）人: 馬會民;王曉春;董素英
• 申請（專利權）人: 中國科學院化學研究所
• 主分類號: C07D403/14
• 分類號: C07D403/14;G01N33/52;G01N33/68
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種可用于標記蛋白分子中巰基的極性敏感熒光探針及其制備方法與應用。

背景技術

光學分析法，特別是熒光光譜法，因具有簡便性、高靈敏度和高時空分辨能力而成為目前應用最廣泛、最有效的研究生物大分子的區域結構與功能的手段之一。在熒光光譜法中，能與目標物質發生標記反應并引起熒光性質的變化，從而可對目標物質進行分析與測定的一類光學分子，稱為熒光探針。應用具有特殊性質的熒光探針，可以對蛋白質的區域結構和性能的關系進行詳細研究，所以性能優良的熒光探針是構筑和發展熒光光譜法的基石，因而一直受到關注。在蛋白組學研究中，大部分蛋白質中的巰基比較活潑，易形成二硫鍵，有的巰基處于活性位點，對蛋白的空間構型以及生物功能有著特殊的作用。因此，巰基的選擇性標記及其附近結構和性質的研究是蛋白組學研究中的重要課題之一。可用于蛋白質中巰基定位標記的熒光探針雖然已有一些報道，但能夠用于研究蛋白質巰基附近物理性能(包括極性、pH等)的熒光探針，尤其是對極性敏感且適于巰基標記的熒光探針還比較少見。Prendergast等人(TheJournal?of?Biological?Chemistry?1983，258：7541-7544)曾設計了可用于巰基選擇性標記的極性敏感探針丙烯酰丹(Acrylodan)，但其熒光發射波長小于550nm。Kenyon等人(Methods?in?Enzymology?1977，47：407-430)利用芘在373nm和384nm處的發射強度的比值(I₁/I₃)與溶劑的極性之間的線性關系曾設計了馬來酰亞胺基芘來測定巰基附近的極性，但是由于發射波長較短，不能完全消除蛋白分子的背景熒光，所以測定的準確性有待改進。到目前為止，波長在550nm以上而且適合于巰基標記的極性敏感熒光探針還沒有文獻報道過。

發明內容

本發明的目的是提供一種能夠用于含有巰基的化合物選擇性標記的極性敏感探針及其制備方法與應用。

該熒光探針為3-(4-氯-6-對馬來酰亞胺苯酚基-1，3，5-三嗪氨基)-7-二甲基氨基-2-甲基吩嗪(3-(4-chloro-6-p-maleimidylphenoxyl-1，3，5-triazinylamino)-7-dimethylamino-2-methyl-phenazine；縮寫為：CMTDP)，其結構如式I，

該CMTDP分子由三部分組成：中性紅作為極性敏感熒光團；三聚氰氯作為橋聯劑；馬來酰亞胺基團作為標記基團。

CMTDP的制備是利用三聚氰氯分子中的三個氯原子的在不同溫度下反應活性的差別而實現的，在0～5℃下先取代三聚氰氯的第一個氯原子，在室溫下取代第二個氯原子。具體的，首先，中性紅與三聚氰氯中的第一個氯原子在0～5℃的冷丙酮中反應，然后再與對馬來酰亞胺苯酚在室溫下發生第二個氯的取代反應，從而得到CMTDP。

本發明涉及的熒光探針CMTDP具有以下特點：1)在絕大多數溶劑中熒光性質穩定；2)具有長的熒光發射波長(＞550nm)，有利于避免來自普通生物大分子的小于500nm背景熒光的干擾；3)最大熒光發射峰位對環境極性十分敏感，極性增加導致發射波長發生紅移，更重要的是，這種漂移只對極性敏感，而不受環境的溫度和pH值的影響。因而，該探針能在熱和酸的變化情況下對極性進行準確的測定。CMTDP由于具有上述性質，而且具有適于巰基標記的選擇性基團-馬來酰亞胺基團，因此，可用于含巰基化合物分析，特別是，用于含巰基的蛋白質的分析，這也屬于本發明的保護范圍。

本發明制備出一種能夠用于含有巰基的化合物的選擇性標記的極性敏感探針，該探針由于馬來酰亞胺基團的引入，可以用于含有巰基的生物大分子的標記及巰基附近區域極性變化情況的測定和研究，特別是蛋白質中巰基的選擇性標記和巰基附近極性變化情況的研究。

附圖說明

圖1為CMTDP在不同溶劑中的熒光發射光譜圖；

圖2為CMTDP的最大發射波長位移值與溶劑介電常數線性關系圖；

圖3為CMTDP在不同pH下的熒光發射光譜圖；

圖4為CMTDP在不同溫度下的熒光發射光譜圖；

圖5為CMTDP標記的β-乳球蛋白及蛋白、探針的吸收光譜圖；

圖6為CMTDP標記的β-乳球蛋白的熒光發射光譜圖；

具體實施方式

實施例1、CMTDP的制備

反應過程用以下反應流程表示：