[發(fā)明專利]從中藥等天然產(chǎn)物混合物備選庫(kù)中篩選SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制劑的新方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710065119.7
• 申請(qǐng)日: 2007-04-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101063234A
• 公開(kāi)（公告）日: 2007-10-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 饒子和;孫玉娜;婁智勇;向科輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南開(kāi)大學(xué);清華大學(xué);中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所
• 主分類號(hào): C40B30/04
• 分類號(hào): C40B30/04;G01N33/573
• 代理公司: 北京三聚陽(yáng)光知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 李紅團(tuán)

1、從川藏香茶菜備選樣品中篩選SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制劑的方法， 其特征在于包括如下步驟：

A：測(cè)定川藏香茶菜備選樣品對(duì)SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制活性，將 SARS冠狀病毒主蛋白酶的晶體與川藏香茶菜備選樣品接觸，得到SARS冠狀病 毒主蛋白酶與小分子抑制劑復(fù)合體的晶體；SARS冠狀病毒主蛋白酶晶體與川藏 香茶菜備選樣品接觸時(shí)，使用的方法為晶體浸泡的方法；

B：收集并分析步驟A中得到的復(fù)合體的晶體的X射線衍射數(shù)據(jù)，獲得與 SARS冠狀病毒主蛋白酶結(jié)合的小分子抑制劑的電子密度；

C：以步驟B中獲得的與SARS冠狀病毒的主蛋白酶結(jié)合的小分子抑制劑的 電子密度為基礎(chǔ)，鑒定與SARS冠狀病毒主蛋白酶結(jié)合的小分子抑制劑，獲得 小分子抑制劑與SARS冠狀病毒主蛋白酶復(fù)合體的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)；

D：測(cè)定小分子抑制劑對(duì)SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制活性；

其中，所述SARS冠狀病毒主蛋白酶晶體結(jié)晶條件為：1.8～12％的PEG 6000，3％二甲基亞砜，1mM?DTT，pH5.0～PH6.0的100mM?MES緩沖液以 及蛋白濃度為5～12mg/ml；

所述川藏香茶菜備選樣品的制備方法包括如下步驟：

(a)、取一定量的川藏香茶菜，用乙醇溶液回流提取，合并提取液，濃縮得 浸膏；其中乙醇溶液與初級(jí)原料的用量質(zhì)量比為6:1-12:1；所用乙醇溶液濃度為 70％-95％；

(b)、稱取一定量步驟(a)中所得的浸膏，用雙蒸水懸浮，用有機(jī)溶劑萃取， 分離有機(jī)溶劑相和水相；合并水相，備用；合并每次有機(jī)溶劑萃取物，蒸除其 中的有機(jī)溶劑，得到干膏狀有機(jī)溶劑相樣品，備用；其中浸膏與懸浮用雙蒸水 的質(zhì)量比為1:5-1:15；萃取用有機(jī)溶劑為乙酸乙酯，其體積與懸浮用雙蒸水的體 積比為6:1-10:1；

(c)、蒸除步驟(b)中萃取后的水相部分的水中溶解的少量有機(jī)溶劑，用HP-20 型大孔樹(shù)脂柱層析分離，依次用水和乙醇溶液為流動(dòng)相洗脫；棄去水洗部分， 蒸除乙醇溶液洗脫部分的溶劑，得干膏狀樣品備用；其中所用乙醇溶液濃度為 50％；

(d)、上述步驟(b)中制得的干膏狀有機(jī)溶劑相樣品和步驟(c)中制得的干膏狀 樣品即為源自初級(jí)原料川藏香茶菜的2個(gè)備選樣品；

步驟A中所述晶體浸泡方法中，浸泡液是用如下方法制備：

方法一、將步驟c制備得到的樣品的DMSO溶解物10倍稀釋至SARS冠狀 病毒主蛋白酶晶體生長(zhǎng)池液，13000—15000rpm高速離心，之后取上清液，得浸 泡液1，備用；

方法二、將步驟b制備得到的樣品直接溶解于SARS冠狀病毒主蛋白酶晶 體生長(zhǎng)池液中，13000—15000rpm高速離心，之后取上清液，得浸泡液2，備用；

浸泡時(shí)，利用尼龍晶體環(huán)工具，將已生長(zhǎng)好的SARS冠狀病毒主蛋白酶的 晶體從結(jié)晶池液中取出，分別加入浸泡液1和2中以及相應(yīng)的10倍稀釋液中， 浸泡2—48小時(shí)。