[發明專利]白喉毒素與GM－CSF突變體的融合蛋白及其編碼基因與應用

無效

• 申請號: 200710065083.2
• 申請日: 2007-04-02
• 公開（公告）號: CN101050238A
• 公開（公告）日: 2007-10-10
• 發明（設計）人: 歐陽晶;王健偉;洪濤
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/63;A61K38/16;A61P35/02;C12N1/21;C12P21/02
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及白喉毒素與GM-CSF突變體的融合蛋白及其編碼基因與應用。

背景技術

急性髓系白血病(Acute?Myeloid?Leukemia，AML)是成人中發病率最高、兒童中發病率第二高的白血病，美國2006年預期新發病例為11,930例。目前用阿糖胞苷等化療藥物治療AML的藥效顯著，完全緩解率可以達到70％。但是大多數患者長期用藥產生耐藥性，最終會死于復發或治療綜合征(complication?of?treatment)。復發和難治性AML患者的存活中數是幾個星期或幾個月，因此急需能夠避免多藥耐藥表型的、具有獨特治療機制的新型藥物。目前已知在88％AML患者的白血病細胞表面過量表達粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte?Macrophage?ColonyStimulating?Factor，GM-CSF)高親和力受體(GM-CSFReceptor，GM-CSFR)，而骨髓中的正常造血祖細胞，多能造血干細胞表面未發現有GM-CSFR(Hogge?DE，WillmanCL，Kreitman?RJ，Berger?M，Hall?PD，Kopecky?KJ，McLain?C，Tagge?EP，EavesCJ，Frankel?AE.Malignant?progenitors?from?patients?with?acute?myelogenousleukemia?are?sensitive?to?a?Diphtheria?Toxin-Granulocyte-MacrophageColony-Stimulating?Factor?fusion?protein.Blood，1998，92(2)：589-595)。因此，GM-CSFR可能成為特異性治療AML的藥物靶標。

免疫毒素作為導向治療藥物，利用抗體、細胞因子等導向部分識別并結合特定的靶細胞表面，內吞進入細胞后，毒素效應部分發揮其細胞毒作用，從而特異性殺傷靶細胞。白喉毒素(Diphtheria?toxin，DT)是一種高效的生物毒素，全長535aa，分子量為58,330D，結構可分為3個彼此獨立的結構域：N端1-193aa是酶活性區(Catalytic?Domain，C區，DTA片段)，205-378aa是跨膜轉運區(TransmembraneDomain，T區)，386-535aa是細胞膜受體結合區(Receptor?Binding?Domain，R區)。這3個結構域在一級結構上不交叉，三級結構上也彼此獨立。在制備融合蛋白免疫毒素時，保存C和T區，R區用配體分子替換。由于白喉毒素類免疫毒素殺滅細胞的機制與傳統治療藥物破壞DNA或細胞分裂的機制不同，是通過C區的ADP核糖基轉移酶活性使真核細胞核糖體中的蛋白翻譯延伸因子EF2失活，抑制細胞蛋白的翻譯表達，并最終誘導靶細胞的凋亡，因此白喉毒素類免疫毒素對復發的、耐化療藥物的腫瘤細胞具有特異殺傷作用。目前唯一經美國FDA批準上市的免疫毒素即采用了截短的白喉毒素和IL2的融合蛋白(DAB₃₈₉-IL2)。因此，以GM-CSFR為靶向的導向藥物將有效地特異性殺傷AML細胞，同時對機體的造血功能不造成嚴重損傷，從而有望為AML患者提供一種新型的、高特異性的治療藥物。目前雖然臨床試驗表明DT₃₈₈-GMCSF有10％的有效性，但是發現DT-GMCSF形式的免疫毒素有2個重要的缺點：首先，其在大腸桿菌中的表達量非常低，不利于大量生產(Williams?MD，Rostovt?sevA，Narla?RK，Uckun?FM.Production?of?recombinant?DTct?GMCSF?fusion?toxin?ina?baculovirus?expression?vector?system?for?biotherapy?of?GMCSF-receptorpositive?hematologic?malignancies.Protein?expr?purif，1998，13：210-221)。雖然有人發現在桿狀病毒表達系統中可以得到高表達，但是由于迄今為止尚無桿狀病毒表達的蛋白藥物得到FDA的批準，可能繼續研制的阻力比較大。其次，在臨床研究中發現具有肝毒性，可能是肝臟的枯比細胞具有GMCSF受體而造成的損傷，(Frankel?AE，Powell?BL，Hall?PD，Case?LD，Kreitman?RJ.Phase?I?trial?of?anovel?diphtheria?toxin/granulocyte?macrophage?colony-stimulating?factorfusion?protein(DT388GMCSF)for?refractory?or?relapsed?acute?myeloid?leukemia.Clin?Cancer?Res，2002，8(5)：1004-13；Westcott?MM，Abi-Habib?RJ，Cohen?KA，Willingham?MC，Liu?S，Bugge?TH，Leppla?SH，Frankel?AE.Diphtheria?toxin-murinegranulocyte-macrophage?colony-stimulating?factor-induced?hepatotoxicity?ismediated?by?Kupffer?cells.Mol?Cancer?Ther.2004，3(12)：1681-9)故而仍需對蛋白進行改進，以降低體內的毒性。