[發(fā)明專利]一種厭氧微生物分離培養(yǎng)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710064715.3
• 申請日: 2007-03-23
• 公開（公告）號: CN101270334A
• 公開（公告）日: 2008-09-24
• 發(fā)明（設計）人: 曹宏斌;潘嘉川;張懿;李玉平
• 申請（專利權）人: 中國科學院過程工程研究所
• 主分類號: C12N1/00
• 分類號: C12N1/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

發(fā)明領域

本發(fā)明涉及一種厭氧微生物的分離方法，尤其是一種極端微生物生理生態(tài)研究、自然生態(tài)研究，遺傳工程研究，生命科學研究，病理學研究，海洋地質(zhì)研究和環(huán)境污染治理中不可缺少的新方法。

背景技術

在自然生態(tài)系統(tǒng)中，微生物扮演著非常重要的角色。在污染治理中，微生物可以分解很多其他方法不能去除的有機或無機污染物，且成本低廉；在地質(zhì)學研究中，不同區(qū)域的特定種類的極端微生物的親緣關系，可能標志著這些區(qū)域以往的位置關系。但微生物往往是以菌群為單位，多種微生物生存在一起，因此，分離獲得微生物的純培養(yǎng)是微生物生理生化研究中必須首先解決的問題。一個新的微生物菌種的發(fā)現(xiàn)，往往會導致微生物學的重大進展，也可能會引起一個新的學科交叉點：比如硝酸鹽還原菌與硝酸鹽廢水的治理，幽門螺旋菌與胃癌的治療等。其中，極端環(huán)境下的微生物往往是環(huán)境、能源、地質(zhì)研究中比較重要的角色，可以給科研工作者提供很多新的思路和方法。但由于其培養(yǎng)的環(huán)境條件難以在常規(guī)條件下得到模擬，極端環(huán)境下的微生物往往是難以純化培養(yǎng)，尤其是要求幾種極端條件同時具備的情況，如要求極端厭氧環(huán)境和高溫環(huán)境同時具備。

微生物的分離和純化的方法及專利有很多，如一次性微生物分離診斷鑒定培養(yǎng)基(專利號：200520003682.8)，一種微生物分離培養(yǎng)方法(專利號：94103474.7)等，但這些分離方法中，多數(shù)為針對分離好氧菌或兼性厭氧菌。

厭氧菌分為非嚴格厭氧菌和嚴格厭氧菌：暴露于氧氣中會造成生長抑制的細菌為非嚴格厭氧菌，暴露于氧氣中造成菌體死亡的稱為嚴格厭氧菌。不同厭氧菌對氧氣的耐受能力不同，一般以耐氧時間作為指標。在耐氧時間內(nèi)，不會造成菌體死亡，菌體的耐氧時間差異很大，從幾秒鐘到數(shù)十小時不等。對于耐氧時間極短的細菌，由于在分離操作的過程中很容易因接觸氧氣而造成菌體死亡，人們往往很難分離到，只能用探針的方法去檢測其核酸片斷，無法得到純培養(yǎng)細菌。而耐氧時間短的細菌多數(shù)生活在極端環(huán)境中，如在深海中由于巨大的水壓，細菌不會和氧氣接觸。極端環(huán)境微生物往往是一個新的物種，對科學研究的意義重大；而且由于極端條件下的樣品很難獲得，所以，從極端條件下分離到的微生物十分珍貴。但是，這種對厭氧條件的嚴格要求造成了分離厭氧菌的極大的障礙。如果沒有得到細菌的純培養(yǎng)，人們就難以在自然的條件下去研究該厭氧菌的代謝機理，對厭氧菌進一步研究受到制約。在對厭氧細菌的檢索中，有很多細菌均被稱為“未培養(yǎng)細菌”。這說明對于厭氧細菌來說，現(xiàn)有的分離技術還有很大的局限性。

目前已報道分離厭氧細菌的方法主要有：

1)利用厭氧工作站對細菌進行分離培養(yǎng)，可以保證分離的全過程中，目的細菌與氧氣隔絕，但是，目前的厭氧工作站中一般設定的培養(yǎng)溫度上限為50℃，難以給嗜熱厭氧菌提供足夠的培養(yǎng)溫度。而且即使欲分離培養(yǎng)50℃以下生長環(huán)境的細菌，一個厭氧工作站只也能設定一個培養(yǎng)溫度，分離培養(yǎng)不同溫度的微生物就需要多個厭氧工作站，極大的提高了實驗成本。同時，厭氧工作站中難以提供嚴格的無菌環(huán)境，培養(yǎng)時，培養(yǎng)皿之間容易互相染菌。

2)利用厭氧罐、厭氧袋及滾管操作分離厭氧微生物，可以提供細菌50℃以上的培養(yǎng)溫度，但整個操作過程暴露于空氣中，目的厭氧菌會與氧氣接觸，造成目的菌體死亡。

3)文獻《一種分離培養(yǎng)硫酸鹽還原菌的改進方法》(萬海清，應用與環(huán)境生物學報，2003，9(5)：561-562)中介紹了疊皿夾層法分離厭氧微生物，但該方法在涂布操作過程中，菌體會短時間內(nèi)暴露于空氣中。如果預分離的細菌的耐氧時間較少，將會造成目的菌體的死亡。

4)文獻《對一種新的厭氧菌培養(yǎng)皿-OxyplateTM的評估》(趙虎?等，上海醫(yī)學檢驗雜志，2002，06)中介紹了利用OxyplateTM培養(yǎng)皿分離厭氧菌的方法，該方法同樣存在于涂布操作過程中，菌體短時間暴露于空氣中，造成菌體死亡。

5)專利一種適合厭氧培養(yǎng)使用的培養(yǎng)皿，(專利號：200420074957.2)，該專利針對醫(yī)療基層機構中厭氧致病菌的發(fā)現(xiàn)和培養(yǎng)，致病菌往往生存在非嚴格厭氧的環(huán)境中，利用這種培養(yǎng)皿分離耐氧時間短的細菌，可能會造成菌體死亡。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是：提供一種簡單且準確的高溫厭氧菌分離方法，該方法能夠在操作全程中避免目的厭氧菌菌體與空氣接觸，并且可以分離50℃以上培養(yǎng)溫度的高溫厭氧菌。

本發(fā)明的具體解決方案為：

1)將含指示劑的瓊脂培養(yǎng)基及帶密封蓋的玻璃管滅菌；