[發明專利]突變羧肽酶原B及突變羧肽酶B的生產方法

有效

• 申請號: 200710064634.3
• 申請日: 2007-03-21
• 公開（公告）號: CN101058805A
• 公開（公告）日: 2007-10-24
• 發明（設計）人: 李素霞;王福清;袁勤生
• 申請（專利權）人: 北京貫虹科技有限公司;華東理工大學
• 主分類號: C12N9/48
• 分類號: C12N9/48;C12N15/57;C12N15/63;C12N1/21;C12P21/06;C12Q1/37;G01N33/68;G01N33/573
• 代理公司: 北京市商泰律師事務所
• 代理人: 毛燕生

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，主要是通過定點突變使得基因表達產物的性能改善的方法。具體的說，是通過選擇使得特定的半胱氨酸位點或其它影響二硫鍵形成的基因位點，使得突變羧肽酶B表達產物的活性提高的方法。

背景技術

胰腺羧肽酶B(carboxypeptidase?B，CPB，EC?3.4.17.2)發現于1958年(參見Folk?JE，Gladner?JA，Carboxypeptidase?B?J?Biol?Chem?1958；231：379-391)。它是一種消化酶，其水平在正常的血清中幾乎檢測不到。只有發生胰腺炎期間，血清中才可發現活性CPB，其血漿半衰期為幾分鐘，這可能是由于沒有糖基化。

羧肽酶B是一種含鋅的胰外肽酶，其中，鋅離子作為酶活性所必需的一種輔因子存在。羧肽酶B可特異性水解肽鏈C端的堿性氨基酸——精氨酸，賴氨酸或鳥氨酸。CPB含307個氨基酸，分子質量35ku。天然存在的CPB是由前羧肽酶原B(preprocarboxypeptidase?B)產生的，其N-末端包含108個氨基酸(其中13個氨基酸為信號肽序列，95個氨基酸組成活性肽部分)的片段與C端的CPB相連，前羧肽酶原B在轉運到內質網的過程中，信號肽被切掉，得到不具酶活性羧肽酶原B(procarboxypeptiedase?B，pCPB)從細胞中分泌出來，然后在小腸中經胰蛋白酶酶解為具酶活性的CPB和活性肽部分。

由于羧肽酶B特異性水解肽鏈C端的堿性氨基酸(精氨酸，賴氨酸或鳥氨酸)，所以羧肽酶B可應用于蛋白質和多肽的序列分析，特別是用來確定羧基端氨基酸。

目前，羧肽酶B最重要的用途是作為工業用酶，特別是應用于胰島素的工業生產中，歐洲專利申請EP-A?0489780中描述了胰島素的制備，在這個申請中，羧肽酶B被用于將胰蛋白酶打開的胰島素原轉變為胰島素的一個必需步驟中。

從豬胰腺中純化的商業化的羧肽酶B有可能沒有完全去除其他蛋白水解酶的活性。此外，如同大多數動物來源的產物的情況，豬胰腺來源的羧肽酶B可能含有感染物質，如病毒、朊病毒、或其他具有損害人體健康潛能的生物活性組分。如果這種酶應用于大規模工業生產，例如工業生產胰島素，另一個不利的因素是獲得和儲存冷藏胰腺的高后勤成本。

除了從胰腺組織中提取羧肽酶B，用生物技術方法生產羧肽酶B是另一替代方法。這一方法中有一些已知的路線，例如表達羧肽酶B前體，即羧肽酶原B，它包括羧肽酶B的氨基酸序列和活性肽序列。大腸桿菌(E.coli)、巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris)等均可作為表達菌株，但表達所得羧肽酶原需經胰蛋白酶激活后獲得活性羧肽酶B，然后再純化去除胰蛋白酶和活性肽部分等。這一方法的另一替代方法是在細菌或酵母中以融合蛋白形式，如β-半乳糖苷酶-羧肽酶B融合蛋白形式表達，但需體外去除融合蛋白才可獲得活性羧肽酶B。

WO?0151624公開了在巴斯德畢赤酵母中豬前羧肽酶B的重組表達。通過胰蛋白酶酶切的方式活化酶原，隨后加入胰蛋白酶抑制劑，疏水柱層析純化得到羧肽酶B，Q-瓊脂糖凝膠層析進一步純化活化的酶。WO0151624的純化方法涉及多個步驟并伴隨著羧肽酶B產物的損失。此外，還需從產物中分離胰蛋白酶、胰蛋白酶抑制劑和羧肽酶B前肽。

DE?19915938公開了在甲基營養巴斯德畢赤酵母中組氨酸標記的人前羧肽酶B的重組表達。利用親和層析憑借組氨酸標記的優點來純化該產物。隨后，利用胰蛋白酶活化前羧肽酶B并通過添加胰蛋白酶抑制劑來終止該活化反應。由于活化步驟施用于溶解的酶原，因此需要進一步將前肽和羧肽酶B純化分開。

WO?9623064中公開了在E.coli中的鼠前羧肽酶B的重組表達。產生了非溶解性的前羧肽酶B的包涵體。該酶原被復性，針對溶解的酶原進行胰蛋白酶的活化步驟，并隨后被進一步純化，將前肽、胰蛋白酶與羧肽酶B分離。我們也對該方法進行了摸索(Su-Xia?Li等，Protein?and?Peptide?Letters2003，10(6)：1-10)。

目前本領域對于通過定點突變技術進行突變CPB的研究并無報道。因此，本領域對于通過突變技術來改變CPB表達，從而進行突變CPB的研究以揭示CPB的結構與功能的關系，從而進一步改善其生產方法具有迫切的需要。

發明內容

因此，本發明的一個目的是提供一種重組生產羧肽酶B的方法。