[發明專利]一種RNAi載體及其應用

無效

• 申請號: 200710064107.2
• 申請日: 2007-02-28
• 公開（公告）號: CN101058819A
• 公開（公告）日: 2007-10-24
• 發明（設計）人: 蔣宇揚;謝振華;馬偉偉;李文鵬
• 申請（專利權）人: 清華大學深圳研究生院
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;A61K48/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及載體及其應用，特別是涉及一種RNAi載體及其在制備抑制靶基因表達的基因治療性藥物中的應用。

背景技術

RNA干擾(RNA?interference，RNAi)是一種在小雙鏈RNA(dsRNA)的介導下降解同源基因的現象。長的dsRNA被加工成21-23nt并包含2個nt懸掛結構的短干擾RNA(siRNA)。siRNA可以和RNA誘導的沉默復合體(RNA?induced?silencing?complex，RISC)結合，續而經過一系列反應，最終沉默特定的內源基因。由于RNAi具有特異性強、沉默效率高的特點，故而被廣泛運用在沉默特定基因上。近些年來，很多基于RNAi的方法被發明出來，特別是利用RNAi沉默特定的癌基因，以便進行基因功能的研究或腫瘤的基因治療。

最初直接使用dsRNA進行基因沉默。雖然雙鏈RNA可以達到不錯的沉默效果，但由于RNA酶廣泛存在于自然界和生物體內，雙鏈RNA會迅速降解，因此無法實現腫瘤的基因治療的目的。舉例來說，在小鼠體內，dsRNA的半衰期大約僅僅只有10秒，所以為了讓藥物到達靶點，必須采用高壓注射的方法，使藥物在短時間內迅速流過整個循環系統。由于人的血容量比小鼠大的多，為了將藥物運送至靶點所需要的壓力更高，超出了人類循環系統所能負擔的極限，因而直接使用dsRNA制備基因沉默藥物是不可行的。同時，由于dsRNA在體內不能自動合成，所以必須定期給藥以便達到長時間的抑制效果，而人工合成dsRNA比較昂貴，因此也將影響直接用dsRNA制備基因治療藥物的前景。

近些年來，為了克服上述困難，基于載體質粒的RNAi技術被發明出來，即將siRNA對應的cDNA插入到載體質粒中，通過轉染的方式將重組質粒導入細胞。在特定啟動子的幫助下，細胞將cDNA轉錄成siRNA，此后繼續進行正常的RNAi過程。由于DNA比RNA更難被降解，同時質粒在細胞內可以自我復制，從而降低了給藥的數量，難度和間隔，并且合成DNA的費用比合成RNA的要低的多，相對于基于dsRNA的藥物具有天然優勢。載體質粒最重要的成分就是采用的啟動子，它直接決定了siRNA的產率，從而決定了沉默效率。目前載體質粒廣泛使用的有pSUPER，pSilencer，pSHAG等，使用的啟動子一般包含U6，H1。最常用的U6和H1啟動子具有結構簡單，轉錄起點明確等優點，但這兩種啟動子的轉錄效率在不同的細胞中，甚至同一細胞不同的靶基因中相差很大，甚至在有些細胞中幾乎不能實現轉錄，同時對于siRNA的序列要求也比較嚴格，從而導致很多情況下靶基因的沉默效果不如人意。

POKEMON，又稱為LRF、OCZF或FBI-1，是POK蛋白家族的一個成員，在細胞分化中起重要作用，被稱為是癌癥基因的總開關，是ARF的特異性抑制子，因此被認為是癌癥基因治療的一個重要靶點。

發明內容

本發明的目的是提供一種可高效、特異抑制靶基因表達的RNAi載體。

本發明所提供的RNAi載體，是在含有多克隆的載體骨架中，含有CMV增強子和tRNA^lys啟動子的重組載體，所述CMV增強子在載體中位于tRNA^lys啟動子的上游；所述CMV增強子的GenBank號為AF239249，tRNA^lys啟動子的GenBank號為140508。

所述載體中還可包含有PBR322復制起點和氨芐青霉素抗性基因等其它核苷酸序列。

以pCMV5為出發載體，構建的含有CMV增強子和tRNA^lys啟動子的重組載體為pExsiler。

上述含有CMV增強子和tRNA^lys啟動子的重組載體均可按照基因工程領域的常規方法構建，其中pExsiler的構建方法可包括以下步驟：

1)以pCMV5質粒載體為模版，在由序列表中序列1和序列2組成的引物對的引導下PCR擴增含有CMV增強子的DNA片段；

2)以Hela細胞基因組DNA為模版，在由序列表中序列3和序列4組成的引物對的引導下PCR擴增人源tRNA^lys啟動子；

3)將步驟1)擴增的DNA片段與步驟2)擴增的人源tRNA^lys啟動子連接，得到RNAi載體pExsiler。