[發明專利]樹狀結構標記物及其制備方法

無效

• 申請號: 200710064101.5
• 申請日: 2007-02-28
• 公開（公告）號: CN101255462A
• 公開（公告）日: 2008-09-03
• 發明（設計）人: 郭良宏;張勤
• 申請（專利權）人: 中國科學院生態環境研究中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64;G01N33/533
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司
• 代理人: 王旭

技術領域

本發明涉及抗原/抗體免疫測試中使用的標記物及其制備方法，特別地，涉及用核酸和熒光分子的結合物對免疫檢測進行多標記的方法。

技術背景

免疫分析方法由于具有高度的特異性、快速、簡便等優勢，已廣泛的應用于生命科學，藥物分析，臨床診斷及環境監測領域。由于免疫反應自身產生的物理變化非常微弱，難于檢測，通常在抗原或抗體上標記產生特異信號的物質或分子，稱為標記物。根據產生信號的不同，標記物可分為放射性同位素、熒光染料、電化學分子、酶、化學發光物、電化學發光物等，其中熒光檢測應用非常廣泛，而且是生物芯片的標準檢測方法。然而，隨著對低豐度蛋白檢測的需求日益迫切，進一步提高熒光免疫試驗的靈敏度成為研究的熱點。在免疫分析方法中，檢測靈敏度的提高主要采取兩種手段：一是體外擴增低豐度蛋白；一是增加信號分子的數量。前者在實際運用中難以實現，因為目前的技術條件難以使蛋白質像核酸(例如：DNA)那樣，采用多聚酶鏈反應在體外擴增。因此，增加信號分子的數量就成為提高蛋白質檢測靈敏度的主要突破口。在免疫分析過程中，信號分子通常是標記于抗體或抗原上，如何將更多的信號分子標記于同一個抗原或抗體上，使檢測信號得到增強，同時不影響抗原或抗體的識別性能，是最大的難點之一。按照標記物和被標記蛋白之間聯結方式的不同，標記方法可分為共價標記和非共價標記兩類。而根據標記物與蛋白聯結位點的數目，又可分為多個位點標記和單個位點標記。一般而言，共價標記的制備難度大于非共價標記，單個位點標記難于多個位點標記。其中單個位點多標記的蛋白標記方法由于在一個蛋白分子上引入了多個標記物，可大幅度地提高檢測信號。同時由于在目標蛋白上只涉及單個聯結位點，可最大限度地減少標記物對目標蛋白免疫活性的干擾，因此兼顧了免疫測試的信號強度和特異性。

采用核酸進行免疫測試標記，在專利和科研文章中已有描述或報道。在美國專利US4748111(公開日：1988-05-31)中，Dattagupta等人描述了一個用核酸作為信號分子載體對免疫測試進行多標記的方法，其中核酸的3’端與免疫測試的蛋白質通過共價鍵連接。在美國專利US4921788(公開日：1990-05-01)中，Deutsch描述了一個免疫測試分析物的單鏈核酸類似物，可是該類似物與抗體結合后，失去了與互補核酸的雜交能力，導致與核酸雙鏈特異性結合的信號分子的信號下降。在美國專利US6280933(公開日：2001-08-28)中，Glazer等人描述了一個用雙鏈核酸作為熒光分子載體對免疫測試進行多標記的方法，其中的熒光分子是核酸嵌入劑并帶兩個正電荷。在美國專利US6117631(公開日：2000-09-12)中，Nilsen描述了一個特定的樹枝狀核酸(DNA?dendrimer)對免疫測試進行多標記的方法。另外，在美國專利US5665539(公開日：1997-09-09)中，Sano等描述了一個稱為免疫PCR(immuno-PCR)的方法，用核酸對免疫測試進行標記，然后通過PCR對核酸標記進行擴增，最后通過核酸定量進行免疫分析。國內目前還沒有這方面的專利。

發明內容

本發明主要是針對現有技術以下幾個方面的不足進行改進：1)為了降低在抗體上標記信號分子的難度，采用非共價的方式引入信號分子載體；2)為了實現單個位點多標記的策略，以核酸為信號分子載體；3)為了獲得簡便且適應范圍更廣的信號分子標記方法，采用非嵌入式核酸結合劑。簡言之，即是以核酸為信號分子載體，通過核酸的多個作用位點引入大量的熒光信號分子，搭建一種由核酸/熒光分子結合體構成的鏈狀標記物，用于免疫檢測。與常規的免疫熒光測試比較，本方法提供的標記物中的熒光信號分子不只一個，而是多個甚至幾十個，因此可以大幅度提高檢測信號的強度，明顯改善檢測靈敏度。與通過化學合成方法制備的有機聚合物、樹枝狀有機分子(dendrimer)、無機復合物和無機納米標記物比較，本方法采用常規生化和化學試劑，易于獲得，價格低廉，操作簡單，重復性好。

本發明的一個方面提供了一種樹狀結構標記物，其包含核酸，熒光分子，和蛋白質/化合物，其中所述的熒光分子與作為載體的核酸通過非嵌入方式結合形成信號標記物，所述信號標記物與蛋白質或化合物以非共價鍵方式連接，形成樹狀結構。

本發明的第二個方面提供了所述樹狀結構標記物的制備方法，其包括下列步驟：

(a)提供核酸作為熒光分子的載體；

(b)以非嵌入方式將多個熒光分子與所述核酸結合，形成高結合率的結合物；和