[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號的外源插入片段的旁側(cè)序列

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710063780.4
• 申請日: 2007-02-09
• 公開（公告）號: CN101240279A
• 公開（公告）日: 2008-08-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 謝家建;王錫鋒;彭于發(fā)
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12Q1/68
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 張濤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的基因序列。具體的說，涉及一種轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號的外源插入片段的旁側(cè)序列。

背景技術(shù)

水稻是我國最重要的糧食作物之一，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)在水稻中的廣泛研究和應(yīng)用，已經(jīng)有多個轉(zhuǎn)基因水稻品系進行了環(huán)境釋放，申請商業(yè)化種植。對轉(zhuǎn)基因植物進行品系特異性的檢測是對轉(zhuǎn)基因植物進行監(jiān)督管理，保障其健康發(fā)展的重要技術(shù)基礎(chǔ)。而轉(zhuǎn)基因植物的外源插入片段的旁側(cè)序列是轉(zhuǎn)基因植物品系最重要的分子特征之一，因此，外源插入片段的旁側(cè)序列是建立轉(zhuǎn)基因植物品系特異性檢測方法的重要技術(shù)資料。

目前已經(jīng)有部分專利和文獻報道了轉(zhuǎn)基因植物外源插入載體旁側(cè)序列，例如：張大兵等人于2006年利用TAIL-PCR方法分析了玉米品系MON863的外源插入片段的旁側(cè)序列，建立了轉(zhuǎn)基因MON863玉米的品系特異性檢測方法。然而，在對現(xiàn)有的專利和文獻的分析中發(fā)現(xiàn)，還沒有任何關(guān)于轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號的外源插入片段的旁側(cè)序列的文章和專利報道。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述領(lǐng)域中的空白，提供了一種轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號的外源插入片段的旁側(cè)序列。

進一步，本發(fā)明還提供該轉(zhuǎn)基因品系特異性的PCR檢測方法。

一種轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號的外源插入片段的旁側(cè)序列，所述旁側(cè)序列為5’端旁側(cè)序列，其特征在于：5’端旁側(cè)序列如SEQ?ID?NO1所示。

一種轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號的外源插入片段的旁側(cè)序列，所述旁側(cè)序列為3’端旁側(cè)序列，其特征在于：3’端旁側(cè)序列如SEQ?ID?NO2所示。

5’端旁側(cè)序列的制備方法，是通過Genome?walking擴增得到。

3’端旁側(cè)序列的制備方法，是通過LD-PCR擴增得到。

轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號的外源插入片段的旁側(cè)序列的定性PCR檢測方法，其特征在于：所述PCR反應(yīng)中的兩條引物組合為權(quán)利要求1所述旁側(cè)序列的特異性引物：一條引物為依據(jù)SEQ?ID?NO1中1-345位序列設(shè)計的正向引物，另一條引物為依據(jù)SEQ?ID?NO1的346-1346位序列設(shè)計的反向引物。

所述正向引物為KF-G2：5’-AGCATGTCACGGTGTCTGTC-3’，

所述反向引物為CpTI-p2：5′-TCCAGAGTTCATCTTTCTCATCATC-3’。

轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號的外源插入片段的旁側(cè)序列的定性PCR檢測方法，其特征在于：所述PCR反應(yīng)中的兩條引物組合為權(quán)利要求1所述旁側(cè)序列的特異性引物：一條引物依據(jù)SEQID?NO2中1-1182位序列設(shè)計的正向引物，另一條引物依據(jù)SEQ?ID?NO2的1183-1867位序列設(shè)計的反向引物。

所述正向序列為1034f：5’-GCAACGATACGTTGTTGTGG-3’，

所述反向序列為1426r：5’-TCTCCTCTCACTCGTGATCG-3’。

根據(jù)Rong等(Rong?et?al，2005，New?Phytologist，168：559-566)報道的用于轉(zhuǎn)化的載體pCUBAC-HYG的結(jié)構(gòu)，其中T-DNA區(qū)域結(jié)構(gòu)見圖1，由hpt抗性基因表達盒、cry1Ac基因表達盒和CpTI基因表達盒組成。本發(fā)明采用常規(guī)方法，提取植物基因組DNA，利用Genome?walking分離法得到5’端旁側(cè)序列1346bp，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO1所示。通過分析，該5’端旁側(cè)序列包括：水稻基因組序列，位于水稻4號染色體(GenBank登記號：AP008210)的33048719-33049063，其核苷酸序列與SEQ?ID?NO.1中從1-345位的核苷酸序列完全相同；filler?DNA，來源于整合過程中的DNA修復(fù)序列，其核苷酸序列與SEQ?ID?NO.1中346-355位的核苷酸序列完全相同；轉(zhuǎn)化載體pCUBAC-HYG部分序列，其核苷酸序列與SEQ?IDNO.1中356-1346位的核苷酸序列完全相同；利用LD-PCR分離法得到3’端旁側(cè)序列1867bp，其核苷酸序列如SEQ?IDNO2所示。通過分析，該3’端旁側(cè)序列包括：轉(zhuǎn)化載體pCUBAC-HYG部分序列，其核苷酸序列與SEQ?ID?NO.2中的1-1182位的核苷酸序列完全相同；水稻基因組序列，位于水稻4號染色體(GenBank登記號：AP008210)的33049063-33049747位，其核苷酸序列與SEQ?ID?NO.2中從1183-1867位的核苷酸序列完全相同。