[發(fā)明專利]一種枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710062503.1
• 申請(qǐng)日: 2007-08-02
• 公開（公告）號(hào): CN101121924A
• 公開（公告）日: 2008-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王立安;成麗霞;李小俊;彭兵;賈宇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河北師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;A01N63/02;C12R1/125
• 代理公司: 石家莊科誠(chéng)專利事務(wù)所
• 代理人: 劉謨培

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌及其菌劑的應(yīng)用，屬于一種廣譜生防、促生菌劑。

背景技術(shù)

半個(gè)多世紀(jì)以來，化學(xué)農(nóng)藥防治病蟲害對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)起了十分重要的作用。但是，隨著化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期和大量使用帶來的農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、病蟲的抗藥性等問題的出現(xiàn)，化學(xué)農(nóng)藥的安全性引起了社會(huì)的普遍關(guān)注，生物防治越來越受到人們的重視。生物防治具有對(duì)人畜安全，無毒害，不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為植物病蟲害防治的重要措施之一。在植物病蟲害生物防治中，尤以蘇云金芽孢桿菌(Bt)防治鱗翅目害蟲最為成功。目前，開發(fā)利用生物殺菌劑防治農(nóng)作物病害已成為生防領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在該領(lǐng)域，具有防病效果的微生物包括：芽孢桿菌、木霉、放線菌等，其中以枯草芽孢桿菌的研究開發(fā)最為活躍，在微生物殺菌劑市場(chǎng)中備受矚目。枯草芽孢桿菌是一種在自然界廣泛存在的微生物，革蘭氏陽(yáng)性，產(chǎn)生耐熱、抗逆的芽孢，在芽孢形成初期分泌各種抗菌物質(zhì)，對(duì)病原真菌有特異性的防治作用，具有顯著的生防潛力。枯草芽孢桿菌具生長(zhǎng)快、營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單，有利于生防菌劑的生產(chǎn)、劑型加工及在環(huán)境中的存活、定殖與繁殖，而且批量生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，成本也較低，施用方便，儲(chǔ)存期長(zhǎng)，是一種理想的生防微生物。目前已明確的枯草芽孢桿菌作為生物殺菌劑的抑菌機(jī)制有以下幾個(gè)方面：一是營(yíng)養(yǎng)和空間位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)；二是分泌抗菌物質(zhì)。目前已確定來自枯草芽孢桿菌的抗菌物質(zhì)有低分子抗菌肽，有環(huán)狀肽或環(huán)狀脂肽，也有些為線狀肽等，這些物質(zhì)能使病原真菌菌絲發(fā)生斷裂、解體、細(xì)胞質(zhì)消解等現(xiàn)象；三是促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增強(qiáng)植物的誘導(dǎo)抗病性。盡管很多枯草芽孢桿菌生防制劑已被證實(shí)具有防治作用，但僅有少數(shù)幾種應(yīng)用于生產(chǎn)，大部分仍處于研究和探索階段。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種枯草芽孢桿菌菌株以及該菌株的干粉菌劑在農(nóng)業(yè)病害防治、水果保鮮等領(lǐng)域中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明人從田間玉米病葉片上分離到一株對(duì)玉米小斑病菌C小種有拮抗作用的細(xì)菌菌株，經(jīng)鑒定屬于典型的枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)，但與其它枯草芽孢桿菌相比其具有廣譜抗病原真菌活性，同時(shí)其干粉菌劑對(duì)鮮桃、葡萄等水果保鮮效果較好，用于黃瓜、番茄、等大棚蔬菜的生產(chǎn)不僅有抗病效果，而且又有促生作用。為了證明該菌株的廣譜抗病原真菌活性，發(fā)明人做了以下工作：

一、枯草芽孢桿菌CGMCC?No.1982菌株的鑒定、誘變及拮抗機(jī)理

1、菌株的形態(tài)

顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，該菌株菌體桿狀，產(chǎn)生芽孢，革蘭氏反應(yīng)為陽(yáng)性。在TSA培養(yǎng)基上菌落呈淺黃色，近圓形，表面干燥、有褶皺，不透明。

2、菌株的生理生化特征

生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定表明，該菌株為好氧菌，接觸酶陽(yáng)性，V-P實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，能產(chǎn)生淀粉酶，對(duì)鹽有一定的耐受性；不能利用丙二酸鹽；不產(chǎn)生卵磷脂酶。

3、菌株16S?rDNA序列的測(cè)定

利用PCR技術(shù)擴(kuò)增該菌株的16S?rDNA序列，獲1514bp全長(zhǎng)片段。將測(cè)序結(jié)果與GeneBank中已知的16S?rDNA進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)與Bacillussubtilis(登錄號(hào)：AY887082)的同源性最高，為99％。

根據(jù)菌體革蘭氏染色、菌落形態(tài)特征的觀察、生理生化測(cè)試及16S?rDNA序列分析結(jié)果，該菌株和枯草芽孢桿菌相吻合，因此將其鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)。

4、菌株的復(fù)合誘變及抗菌活性提高

采用紫外線和氯化鋰對(duì)菌株進(jìn)行復(fù)合誘變處理，獲得了遺傳性狀穩(wěn)定的誘變菌株，其對(duì)致病真菌玉米小斑病菌的拮抗活性比出發(fā)菌株提高了66.2％。

5、菌株拮抗物質(zhì)的理化特性分析

將菌株接種于LB液體培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)48h，用高速離心機(jī)12，000r/min離心5min去菌體，上清液加入30％飽和度的硫酸銨，4℃靜置過夜后，12,000r/min離心25min，取上清液，加入硫酸銨使達(dá)到60％飽和度，4℃靜置過夜后，12,000r/min離心25min，得到具拮抗活性的蛋白性質(zhì)粗提物。

對(duì)拮抗物的理化特性分析表明，菌株產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)能耐高溫(100℃，10min)，抑菌活性pH值范圍為5.0～9.0，對(duì)紫外線、胰蛋白酶部分敏感，對(duì)蛋白酶K、氯仿敏感，說明該拮抗蛋白穩(wěn)定性較好。

6、菌株拮抗物質(zhì)的拮抗機(jī)理