[發(fā)明專利]一種治療習(xí)慣性流產(chǎn)的生物學(xué)制劑

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710062487.6
• 申請日: 2007-07-31
• 公開（公告）號: CN101129405A
• 公開（公告）日: 2008-02-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 崔瀓;楊彥忠
• 申請（專利權(quán)）人: 崔澂
• 主分類號: A61K35/14
• 分類號: A61K35/14;A61P15/06;C12N5/08
• 代理公司: 石家莊冀科專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司
• 代理人: 李羨民;郭紹華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用非細(xì)胞成分取代傳統(tǒng)細(xì)胞成分制作治療不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)的免疫學(xué)制劑，屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

習(xí)慣性流產(chǎn)是指連續(xù)發(fā)生三次或以上流產(chǎn)者，發(fā)病率約占總?cè)焉飻?shù)的1％，占自然流產(chǎn)數(shù)的15％，為一種嚴(yán)重危害孕婦身心健康的產(chǎn)科疾病。臨床曾有病例連續(xù)發(fā)生7次流產(chǎn)者，病人十分痛苦。此種疾病病因十分復(fù)雜，包括遺傳因素、解剖異常、內(nèi)分泌異常、感染等等，但是，在排除上述臨床病因后，仍有59.42％的習(xí)慣性流產(chǎn)患者，稱為不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)URSA(Unexplanted?recurrent?spontaneous?abortion)，它與母體免疫因素有關(guān)，已成為目前人們關(guān)注的熱點(diǎn)。目前臨床上將URSA患者分為自身免疫型和同種免疫型兩大類，其中國內(nèi)外針對同種免疫型URSA患者，常規(guī)采用“免疫細(xì)胞過繼療法”進(jìn)行治療，旨在誘導(dǎo)受孕母體對半同種異體胎兒抗原的免疫耐受，幫助孕婦度過危險(xiǎn)期。

雖然此方法的療效較肯定，國內(nèi)外報(bào)道有效率達(dá)70％-95％，但仍存在以下不足，從而限制了它的臨床應(yīng)用：(1)治療用免疫細(xì)胞的制備難度較大；(2)個體之間差異較大，影響療效的穩(wěn)定性；(3)免疫細(xì)胞的新鮮分離穩(wěn)定性差，因此，使用免疫細(xì)胞的技術(shù)方案仍然不是人們理想的方案。

有資料表明，采用丈夫或無關(guān)男性個體淋巴細(xì)胞過繼治療的療效無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且發(fā)揮免疫耐受誘導(dǎo)作用的是T細(xì)胞。這說明，采用男性同種異體T細(xì)胞進(jìn)行過繼轉(zhuǎn)輸均可能通過不同男性個體T細(xì)胞上的某些共同抗原成分發(fā)揮作用，誘導(dǎo)母體對半同種異體胎兒抗原的免疫耐受；而T細(xì)胞在生長增殖過程中分泌釋放的一種稱為exosomes的非細(xì)胞成分膜性微囊結(jié)構(gòu)，濃縮了整套T細(xì)胞自身的抗原成分，并可克服細(xì)胞成分治療的諸多缺點(diǎn)，有可能開辟一條新的治療免疫性疾病的道路。目前采用exosome進(jìn)行臨床應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)室探索，多局限于做為生物治療載體應(yīng)用于腫瘤治療，以促進(jìn)機(jī)體的抗瘤免疫效應(yīng)為目的。但有關(guān)其做為免疫耐受誘導(dǎo)劑用于習(xí)慣性流產(chǎn)的治療，則尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，更不用說進(jìn)入實(shí)用治療的制劑了。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所用于克服已有技術(shù)的不足、從而提供一種便于臨床規(guī)范使用的治療習(xí)慣性流產(chǎn)的生物學(xué)制劑。

本發(fā)明的問題是以下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種治療習(xí)慣性流產(chǎn)的生物學(xué)制劑，它以男性外周血為原材料，并按下述步驟進(jìn)行：

a.培養(yǎng)男性外周血T細(xì)胞：

抽取健康成年男性外周血50ml；玻璃球脫纖維Hanks液1.5倍稀釋，分離淋巴細(xì)胞，收集單個核細(xì)胞；Hanks液清洗，用RPMI-1640完全培養(yǎng)液重懸、計(jì)數(shù)，并調(diào)整細(xì)胞濃度至2×10⁶/ml，加入植物血凝素(PHA)，使終濃度為100μg/ml；37℃培養(yǎng)72h；收集培養(yǎng)液的上清，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

b.制備T細(xì)胞exosomes：

取上述外周血T細(xì)胞培養(yǎng)上清，以1500g離心10min去除細(xì)胞及細(xì)胞碎片；分子量100000超濾管過濾濃縮5倍后；以30mg/ml蔗糖/D₂O為密度墊，以100000g超速低溫離心75min，收集底部的緩沖墊；PBS稀釋，100000g超速低溫離心75min，獲得exosomes；0.22μm無菌濾膜過濾分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

上述治療習(xí)慣性流產(chǎn)的生物學(xué)制劑，所述體外培養(yǎng)應(yīng)換用新鮮含PHA的培養(yǎng)液、在體外反復(fù)刺激、培養(yǎng)，均至鏡下觀察轉(zhuǎn)化率大于75％。

一種治療習(xí)慣性流產(chǎn)的生物學(xué)制劑的用途，可用于制備治療習(xí)慣性流產(chǎn)、自身免疫性疾病的藥劑或器官移植后免疫耐受的誘導(dǎo)劑。

本發(fā)明提供了一種非細(xì)胞免疫生物學(xué)制劑，它能有效地誘導(dǎo)機(jī)體的免疫耐受，克服了免疫細(xì)胞過繼療法誘導(dǎo)免疫耐受的諸多不足，使臨床應(yīng)用更為簡單易行；本制劑可以按照GMP標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化制備，使質(zhì)量控制更為穩(wěn)定、可控性更強(qiáng)。將其應(yīng)用于治療習(xí)慣性流產(chǎn)，取得良好的療效。本發(fā)明提供的生物學(xué)制劑，其機(jī)理也可用于其他自身免疫性疾病、器官移植后免疫耐受的誘導(dǎo)，等等。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明分為兩大步驟，一是健康成年男性外周血T細(xì)胞的體外刺激和培養(yǎng)，二是以離心超濾及蔗糖密度梯度離心法制備T細(xì)胞exosomes。