[發明專利]用種子類原球莖誘導四倍體秋石斛蘭新品種的方法

無效

• 申請號: 200710061226.2
• 申請日: 2007-09-28
• 公開（公告）號: CN101124889A
• 公開（公告）日: 2008-02-20
• 發明（設計）人: 李秀蘭;陳力;陳成彬;宋文芹;陳瑞陽
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: A01H1/08
• 分類號: A01H1/08;A01H1/02;A01H4/00;C12Q1/68;A01G1/00
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技術領域

本發明涉及蘭花新品種的培育方法，特別是用種子類原球莖(PLBs)培育四倍體秋石斛蘭新品種的方法。

背景技術

秋石斛蘭(Dendrobiumsp.)又稱蝴蝶石斛，多是以原產于新幾內亞的熱帶原生種蝴蝶石解(DendrobiumPhalaenopsis)為親本育成的雜交品種。秋石斛蘭是一種新型的高檔切花蘭花品種，具有很高的欣賞性，市場需求量較大，在國際和國內花卉產業中占有重要地位。近年我國大陸引進了不少秋石斛蘭品種。但是，迄今為止，國內外秋石斛蘭花均為二倍體品種，尚未見多倍體秋石斛蘭花的報道。多倍化后最直接的效應是植物的根、莖、葉、和花的變大，因此，多倍化育種在觀賞園藝中是最有效的育種方法之一，通過多倍體育種可以獲得大花型蘭花新品種。

發明內容

本發明的目的是提供一種用種子類原球莖(PLBs)培育四倍體秋石斛蘭新品種的方法，可以克服通常多倍體誘變頻率低的缺點。方法簡單，而且大幅度地提高了多倍體誘變頻率高，供選種之用，應用價值高。

本發明提供的一種用種子類原球莖誘導四倍體秋石斛蘭新品種的方法包括以下步驟：采用人工授粉后胚齡的未成熟秋石斛蘭種子，在1/2MS液體培養基中進行非共生萌發培養，在培養60天后，換入含有0.02％Oryzalin(C₁₂H₁₈N₄O₆S)的1/2MS液體培養中處理，后轉入1/2MS固體培養基上，光照下，繼續培養，直至秋石斛蘭苗形成，按常規的方法進行秋石斛蘭栽培移植和管理，直至開花。

本發明提供的一種用種子類原球莖誘導四倍體秋石斛蘭新品種的方法包括以下步驟：

1)秋石斛蘭的人工授粉：秋石斛蘭按常規方法進行栽培管理，在開花后的5～10天進行人工授粉，授粉后的秋石斛蘭，放在通風、半透光條件下進行管理，溫度保持在15～20℃，濕度30～50％，防止落花、落果。

2)秋石斛蘭種子非共生萌發培養：在人工授粉后150～180天，當秋石斛蘭蒴果發育正常(如圖1所示)，取秋石斛蘭種子，用剪刀剪下蒴果(用消過毒的解剖刀)，在超凈工作臺內用75％酒精消毒1分鐘，再用0.1％升汞消毒10分鐘，無菌蒸餾水沖洗5遍，沿果實縱軸方向切開，將秋石斛蘭種子接種在1/2MS液體培養基中振動或靜止非共生萌發培養；

3)秋石斛蘭多倍體誘導：將非共生萌發的秋石斛蘭種子轉入含有0.02％Oryzalin(C₁₂H₁₈N₄O₆S)的1/2MS液體培養基中，誘變處理。

4)秋石斛蘭多倍體幼苗培養：將誘變處理后的秋石斛蘭種子轉入1/2MS固體培養基上繼續培養，直至秋石斛蘭苗形成。

5)秋石斛蘭苗多倍體的鑒定：在瓶苗移栽時，按株編號，分別取新生長的根尖，放入對二氯代苯飽和水溶液中，前處理4小時，后轉入甲醇∶冰醋酸(3∶1，體積)固定液中固定4小時以上，4℃冰箱中保存備用；用壓片法制備染色體標本，用卡寶品紅染色液染色，顯微鏡觀察染色體數目，選取染色體數目為2n＝76的幼苗，是加倍成功的同源四倍體秋石斛幼苗；其他染色體數目的幼苗為非整倍體，不是加倍成功的四倍體，不能使用。

6)四倍體秋石斛蘭的栽培管理：將加倍成功的秋石斛蘭苗，進行移植，待瓶苗長至3-4片葉時，將瓶蓋打開，進行練苗3-5天，然后用清水輕輕地冼凈培養基，將瓶苗移栽在蘭花土+火燒土+松針土(重量比為1∶1∶1)基質中，放在陰涼處，按常規的秋石斛蘭進行栽培管理，防止病蟲害，直至開花。

步驟1)在秋石斛蘭花開花5～10天內進行人工雜交授粉，取自花或同株異花花粉進行授粉。

步驟2)所述的非共生萌發培養是在黑暗或弱光下，室溫25～27℃條件下進行非共生萌發培養60天。

步驟3)所述的誘變處理是在培養60天后，當種子類原球莖(PLBs)發育成球形時，即原胚期，進行多倍體誘變處理150-180小時。可顯著地提高了多倍誘變頻率，可以獲得大量四倍體秋石斛蘭苗。

步驟4)所述的繼續培養是在光周期14小時/天，光強度3000Lux，室溫25～27℃條件下進行。

步驟5)所述的移植方法：待瓶苗長至3-4片真葉后，打開瓶蓋進行練苗3-5天，然后用清水輕輕地洗去培養基，移栽在蘭花土+火燒土+松針土(重量比為1∶1∶1)基質中，放在陰涼處，按一般石斛蘭花進行精心管理，防止病蟲害。