[發明專利]銅綠假單胞菌生物被膜形成相關基因fimL及應用

無效

• 申請號: 200710060181.7
• 申請日: 2007-12-26
• 公開（公告）號: CN101195826A
• 公開（公告）日: 2008-06-11
• 發明（設計）人: 單志英;白芳;徐海津;張秀明;白艷玲;喬明強
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;A61K48/00;A61P31/04
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司
• 代理人: 侯力

【技術領域】：本發明屬于微生物生物技術領域，特別涉及一種銅綠假單胞菌生物被膜形成相關基因，即鞭毛運動相關基因fimL。

【背景技術】：銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)屬假單胞菌屬，革蘭氏陰性菌，它是一種分布廣泛的條件致病菌，在臨床上，它能引起菌血病、耳、眼、皮膚及軟組織、骨及關節、心內膜和呼吸系統等的感染，是人類的三大致病菌之一，是引起肺炎的首要致病菌。由于其具有形成生物被膜等多重耐藥機制，耐藥率高，常在臨床上引起頑固性、難治性感染，成為臨床治療的棘手問題。

細菌生物被膜或稱為菌膜，是細菌為適應不利的自然環境、維持自身生命而發生的形態學變化，形成一種有利于生存的特有的生命現象。當生物體內的細菌處于生長發育不利的環境時，菌體周邊會分泌多糖復合物，使細菌相互粘連，附著于惰性物體如生物醫學材料或粘膜表面并將其自身包繞在其中而形成的膜狀物，使細菌可以停留在一個適宜的微環境中而不會被沖散。生物被膜的這種特殊結構可以作為一種屏障保護細菌抵御抗菌藥物的殺傷和逃逸宿主免疫系統的清除，而成為潛在的感染源，導致難治性臨床生物被膜的相關感染。鞭毛介導的泳動(swimming?motility)和IV型菌毛介導的蹭動(twitching?motility)都參與了生物被膜的早期形成。其中，蹭動是指細菌在固相表面上，依靠IV型菌毛的收縮和延伸，向周圍運動的能力。

對生物被膜形成機制的研究，國內尚未見相關報道。由于生物被膜有非常重要的臨床意義，最近幾年，已引起國外一些科學家的重視，使他們涉足此領域進行研究。但其形成機制仍有許多未知領域等待探索。目前已知，生物被膜的形成大致分為三步：個體細胞的吸附；微菌落的形成；及成熟被膜的發育。我們對銅綠假單胞菌生物被膜形成相關基因fimL的研究可以填補國內這一領域的空白，并完善銅綠假單胞菌生物被膜形成的機理。

【發明內容】：本發明目的是提供銅綠假單胞菌生物被膜形成相關基因、即鞭毛運動相關基因fimL，并用該基因為新藥靶點研制抑制銅綠假單胞菌的新型藥物。

本發明提供的銅綠假單胞菌鞭毛運動相關基因fimL，具有如序列表所示核苷酸序列，其基因長度為1689bp，位于銅綠假單胞菌基因組169節10946-10950。

上述的銅綠假單胞菌鞭毛運動相關基因fimL可以用于以該基因為新藥靶點設計并制備抗菌藥物；以及在食品衛生和耐藥防治諸方面的應用。

本發明基因的獲得方法：使用人工Mu轉座技術(一種基于噬菌體Mu轉座子的轉座技術)，造成銅綠假單胞菌基因突變，建立突變子文庫。篩選蹭動能力喪失的突變子，使用Bam?HI酶切基因組DNA，酶切片段與pUC18載體連接，通過電轉化將連接產物導入大腸桿菌DH5α，用卡那霉素和氨芐青霉素雙抗LB平板篩選陽性轉化子，測定轉化子中插入片段的核苷酸序列，發現Mu插入的基因，確定此基因與銅綠假單胞菌鞭毛運動有相關性。

本發明的有益效果：

實驗發現本發明基因的缺失能夠使IV型菌毛介導的蹭動能力喪失。

Mu插入失活的基因泳動能力喪失，說明此基因與銅綠假單胞菌鞭毛的運動有關，這對鞭毛運動相關新基因的發現以及揭示新基因的功能都有指導意義。

通過本發明，可以針對fimL基因設計藥物，限制其正常表達，使得細菌無法通過蹭行運動形成生物被膜，降低其耐藥性，達到治療銅綠假單胞菌引起的感染的目的。

【附圖說明】：

圖1是蹭動能力喪失的陽性轉化子的蹭動運動檢測圖，

1、野生型PA68作為陽性對照??2、fimL::Mu?PA6g突變株

圖2是Mu克隆子酶切產物電泳圖，1、DL15000?2、質粒3、質粒酶切

圖3是Mu轉座子PCR產物電泳圖(用PCR方法檢測轉化子的Mu轉座子)，

4、DL2000??5、Mu克隆子PCR產物。

用Mu-kam?P1和Mu-kam?P2作為引物，克隆子質粒DNA為模板，可以擴增出700bp的特異性片段，說明所檢測的克隆子質粒中攜帶著插入了Mu轉座子的基因片段。

【具體實施方式】：

實施例1：使用Mu轉座技術進行突變子文庫的建立

(1)將臨床分離株銅綠假單胞菌PA68接種于50ml?L-broth培養基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉，5g/LNaCl)中，37℃，200rpm振蕩培養過夜。

(2)次日按1∶100接種至200ml?L-broth培養基中，200rpm，37℃培養至OD₅₄₀≈0.5，終止培養。