[發明專利]BPDE致癌相關基因的全基因組篩選方法

無效

• 申請號: 200710058411.6
• 申請日: 2007-07-27
• 公開（公告）號: CN101113474A
• 公開（公告）日: 2008-01-30
• 發明（設計）人: 陳照立;李君文;王景峰;金敏;王新為;諶志強;邱志剛
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所
• 代理人: 陸藝

1.BPDE致癌相關基因的全基因組篩選方法，包括如下步驟：

(1)從正常肺組織中提取基因組DNA；

(2)AFLP?DNA片段的制備：基因組DNA經雙酶切獲得AFLP?DNA片段；

(3)與BPDE相互作用的AFLP?DNA片段的免疫磁性富集、分離：AFLP?DNA片段與BPDE孵育形成AFLP?DNA-BPDE加合物，加入針對BPDE抗原的免疫納米磁性顆粒，在磁場作用下，使與BPDE相互作用的AFLP?DNA片段的富集并分離出來；

(4)AFLP?PCR擴增：AFLP?DNA片段與接頭的連接，預擴增和選擇性擴增；

(5)AFLP選擇性擴增PCR產物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染色；

(6)差異片段的回收、擴增、克隆、測序及同源相似性檢索分析。

2.根據權利要求1所述的一種BPDE致癌相關基因的全基因組篩選方法，其特征是所述AFLPDNA片段的制備為：

(1)用Taq?I消化：準備4-6個反應體系，每個反應體系總體積為20μl，其中包括：DNA?300ng，Taq?I?10u，1×buffer，其中1×buffer的成分終濃度為：50mM?Tris-HCl?pH8.0，10mM?MgCl₂，50mM?NaCl，混勻后，65℃恒溫水浴消化1～3h；

(2)向每一反應體系中補加Pst?I?10u，37℃恒溫水浴消化1～3h后，70～75℃水浴10～20min滅活酶的活性，4～8℃保存備用；

(3)1.5％瓊脂糖凝膠電泳觀察基因組DNA的酶切情況。

3.根據權利要求1所述的一種BPDE致癌相關基因的全基因組篩選方法，其特征是所述與BPDE相互作用的AFLP?DNA片段的免疫磁性富集、分離的步驟為：

(1)納米磁顆粒免疫分離BPDE-DNA片斷：

1)取所述AFLP?DNA片段20μl，分成4組放入試管中：免疫磁性特異分離組、免疫磁性非特異吸附組、裸磁顆粒非特異吸附組、正常對照組；

2)向所述免疫磁性特異分離組的試管中加入2?mmol/L的BPDE?0.5～2μl，其余各組分別加入0.5～2μl滅菌超純水，37℃避光孵育3～7d；

3)向所述免疫磁性特異分離組的試管中加入體積比為10∶4的乙酸乙酯和乙醚20～22μl，輕搖混勻，靜置1～4min，除去含有未結合BPDE的上層液相，重復2～4次，純化、沉淀DNA-BPDE加合物，加20μl水重懸DNA-BPDE加合物；

4)向所述免疫磁性特異分離組和免疫磁性非特異吸附組中加入針對BPDE抗原的免疫納米磁性顆粒0.5～2μl，向所述裸磁顆粒非特異吸附組中加入裸磁顆粒0.5～2μl，向所述正常對照組中加入滅菌超純水0.5～2μl，室溫、避光、輕搖10～30min；

5)把各試管放入磁分離架上，在磁場作用2～5min，磁顆粒貼附在管壁一側，小心吸棄上清液，用滅菌超純水30～40μl洗2～4次，每次2～5min；

6)加5μl滅菌超純水溶解，即得到與BPDE相互作用的AFLP?DNA片段免疫納米磁顆粒復合物溶液；

(2)AFLP-DNA片段與磁顆粒的解離

把步驟(1)中得到的放置有與BPDE相互作用的AFLP?DNA片段免疫納米磁顆粒復合物溶液的試管放入沸水浴中10～15min，然后8000～11000r/min離心5～10min，收集上清液，使AFLP-DNA片段與抗原抗體磁顆粒復合物解離，即獲得含有與BPDE相互作用的AFLP?DNA片段，-20℃凍存備用。