[發明專利]以螢火蟲熒光素酶為報告基因的BIV感染性指示細胞系

有效

• 申請號: 200710057671.1
• 申請日: 2007-06-19
• 公開（公告）號: CN101100674A
• 公開（公告）日: 2008-01-09
• 發明（設計）人: 喬文濤;姚雪;陳啟民;耿運琪
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N15/65
• 分類號: C12N15/65;C12N15/53;C12N5/10
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司
• 代理人: 侯力

【技術領域】

本發明涉及一種用于檢測牛免疫缺陷病毒感染的細胞系，以及該細胞系的建立方法和它的具體應用。

【背景技術】

牛免疫缺陷病毒(Bovine?immunodeficiency?virus，BIV)與人免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiency?virus，HIV)同屬于反轉錄病毒科慢病毒屬，與HIV基因組高度同源，其遺傳、復制方式、與宿主細胞的相互關系、致病機理等與HIV極其類似，用其作為一種艾滋病研究模型，用于探討慢病毒基因表達調控、慢病毒與其它病毒超感染后病毒間以及病毒與宿主細胞間的相互作用，具有很高的安全性。建立BIV指示細胞系是研究BIV的分子生物學的有力工具。

指示質粒穩定轉染可以被病毒感染的細胞系，該細胞系稱為指示細胞系。該細胞系的基因組含有被病毒反式激活因子的應答元件調控的報告基因，病毒感染或病毒的反式激活因子可以特異性啟動病毒反式激活因子的應答元件下游的報告基因的表達，通過檢測報告基因產物，指示病毒的感染。傳統的在細胞培養中病毒感染的識別方法主要有觀察細胞病變法。細胞病變法測定的病毒滴度依賴實驗者的肉眼觀察，主觀性較大，不同實驗者可能得出不同的結果。與傳統的檢測方法相比，指示細胞系具有快速，簡便，靈敏的特點。

【發明內容】

本發明的目的是提供一株可以快速簡便地檢測牛免疫缺陷病毒或病毒反式激活因子的指示細胞系以及該細胞系的應用。

本發明提供的指示牛免疫缺陷病毒(Bovine?immunodeficiency?virus，BIV)感染的細胞系，已于2007年5月16日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”(北京市海淀區中關村北一條13號，中國科學院微生物研究所)，其保藏號為CGMCCNo.2049。

本發明提供的細胞系的制備方法如下：

首先構建成一個可以應答牛免疫缺陷病毒感染的指示質粒，該質粒具有序列表所示核苷酸序列；即螢火蟲熒光素酶(firefly?luciferase)的基因插入到一種特異應答牛免疫缺陷病毒反式激活因子的應答元件下游，質粒含有G418抗性基因；所述的特異應答牛免疫缺陷病毒反式激活因子的應答元件是BIV?LTR全長序列。

之后，將該質粒轉染幼倉鼠腎細胞(Baby?Hamster?Kidney?cell，BHK-21)，加入G418進行篩選穩定表達的細胞系，初篩三周后，將抗性細胞進行單克隆化；通過轉染BIV反式激活因子48小時后檢測螢火蟲熒光素酶的活性來分別鑒定每個單克隆特異響應BIV反式激活因子的能力，最終挑選經過BIV病毒攻擊后螢火蟲熒光素酶的活性明顯增高的陽性克隆即為BIV的指示細胞系。

本發明提供的檢測牛免疫缺陷病毒或病毒反式激活因子的新方法是：BIV感染或BIV反式激活因子Tat轉染BIV指示細胞系，BIV指示細胞系的螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase)基因表達，通過檢測熒光素酶活性指示BIV的感染或BIV?Tat的激活。

本發明的優點和積極效果：

本發明提供的檢測方法具有以下優點：熒光素酶的活性可以用生物發光檢測儀定量檢測，從而指示BIV的感染性；指示質粒穩定整合到細胞基因組中，比瞬時轉染的方法更平行，可靠。

該細胞系應用可示例于如下：共培養方法檢測BIV病毒的感染，檢測BIV?Tat的激活作用，檢測JDV?Tat的激活作用，鑒定某種因子對BIV復制的抑制或促進作用，鑒定某種因子對BIV?Tat的抑制或促進作用。

本發明的應用價值在于：

(1)BIV分子生物學研究的有力工具。對BIV的深入了解，有助于了解同屬反轉錄病毒的HIV的分子特性，推動慢病毒的基礎研究。

(2)應用于JDV的分子生物學的研究。JDV是近年新發現的一種使牛急性發病的反轉錄病毒，但目前對其了解甚少。JDV基因組與BIV有很高同源性。JDVTat同樣能夠激活BIV?LTR，應用指示細胞系可以指示JDV?Tat的激活作用。

(3)BIV與HIV的分子生物學特性相近，但BIV不感染人，可以不用在P3實驗室操作。應用該指示細胞系和BIV病毒建立抗反轉錄病毒感染的藥物篩選模型，對有抗AIDS活性的藥物進行初篩，從而降低研究的安全風險，操作簡便。

【具體實施方式】

實施例1

BIV感染性指示細胞系的建立

1.構建指示質粒