[發(fā)明專利]新一代早期診斷前列腺癌試劑盒及其制備方法和檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710057663.7
• 申請(qǐng)日: 2007-06-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101329343A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-12-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周澤奇;吳澄宇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津迪愛(ài)盟生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/577
• 分類號(hào): G01N33/577;G01N33/574;G01N21/78
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種用于定量檢測(cè)前列腺病人血清中前列腺特異抗原與α1-抗糜蛋白酶復(fù)合蛋白標(biāo)記物的免疫酶聯(lián)雙抗體夾心法試劑盒，其組分包括：

1)抗總前列腺特異抗原(抗原包括游離前列腺特異抗原和復(fù)合前列腺特異抗原)的單克隆抗體，作為免疫酶聯(lián)雙抗體夾心法試劑盒捕獲抗體；

2)溶于磷酸緩沖液中的小牛血清白蛋白(2％)，以排除非特異性反應(yīng)；

3)前列腺特異抗原與α1-抗糜蛋白酶復(fù)合物(PSA-ACT)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于定量分析；

4)抗前列腺特異性抗原與α1-抗糜蛋白酶復(fù)合物抗體和堿性磷酸酶或辣根過(guò)化物酶藕聯(lián)結(jié)合物，用于標(biāo)記檢測(cè)前列腺特異抗原與α1-抗糜蛋白酶復(fù)合蛋白；

5)含有吐溫(0.05％TWEEN-20)的磷酸洗滌液；

6)稀釋樣品的磷酸鹽緩沖液；

7)陰性對(duì)照，為正常女性血清樣品(不含前列腺特異抗原與α1-抗糜蛋白酶復(fù)合物存在)；

8)陽(yáng)性對(duì)照，含有前列腺特異抗原與α1-抗糜蛋白酶復(fù)合物的前列腺病人血清樣品。

2.一種新的定量檢測(cè)前列腺病人血清中前列腺特異抗原與α1-抗糜蛋白酶復(fù)合物試劑盒的制備方法，其特征如下：

1)捕獲總PSA單克隆抗體包被的酶聯(lián)板制備

將捕獲抗體加至PBS磷酸鹽緩沖液中均勻，加至酶聯(lián)板孔內(nèi)(100微升/孔)，室溫下孵育二小時(shí)后，棄去孔內(nèi)液體。用含有0.05％吐溫的磷酸鹽緩沖液洗滌三次，將酶聯(lián)板拍干，再加入溶于TRIS中的2％小牛血清白蛋白溶液(250微升/孔)。在室溫下孵育一小時(shí)后，棄去板孔內(nèi)的液體，洗滌三次，用不干膠片貼于酶聯(lián)板上，放入2-8度冰箱中保存待用。

2)制備前列腺特異抗原與α1-抗糜蛋白酶復(fù)合蛋白，用其作為于標(biāo)準(zhǔn)曲線

將游離前列腺特異抗原藕聯(lián)到α1-抗糜蛋白酶分子上，形成前列腺特異抗原與α1-抗糜蛋白酶復(fù)合蛋白(PSA-ACT)。將經(jīng)純化獲得的前列腺特異抗原與α1-抗糜蛋白酶復(fù)合物(PSA-ACT)標(biāo)記物保存在10毫摩爾醋酸鈉/150毫摩爾氯化鈉緩沖液/0.05％sodium?azide(w/v)，pH?5.6中備用。

3)酶聯(lián)檢測(cè)抗體結(jié)合物的制備

將堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合到抗前列腺特異抗原與α1-抗糜蛋白酶復(fù)合物抗體上，獲得高純度的酶聯(lián)檢測(cè)抗體結(jié)合物待用。

4)其它試劑盒組分的制備

A.洗滌液為含有0.05％吐溫的磷酸鹽洗滌液；

B.顯色用的酶底物(藍(lán)磷，Blue?Phos)為堿性磷酸酶的底物；ABTS為辣根過(guò)氧化物酶底物；

C.顏色反應(yīng)終止液為2當(dāng)量的硫酸溶液；

D.陰性對(duì)照為正常女性血清，不含有前列腺特異抗原與α1-抗糜蛋白酶復(fù)合物血清樣本；

E.陽(yáng)性對(duì)照為含有前列腺特異抗原與α1-抗糜蛋白酶復(fù)合物的前列腺病人血清樣本。

3.一種新的用于定量檢測(cè)血清樣品中前列腺特異抗原與α1-抗糜蛋白酶復(fù)合物的檢測(cè)方法，其步驟如下：

A.點(diǎn)樣：血清樣品、前列腺特異抗原與α1-抗糜蛋白酶復(fù)合蛋白樣品以及對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣品(包括陽(yáng)性、陰性對(duì)照和空白對(duì)照)加入到有捕獲抗體包被的酶聯(lián)板內(nèi)。用磷酸鹽緩沖液稀釋血清樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，每個(gè)樣品雙份重復(fù)。在室溫下孵育二小時(shí)后，棄去孔內(nèi)液體，洗滌三次，拍干。

B.加入酶聯(lián)檢測(cè)抗體結(jié)合物(100微升/孔)。除空白對(duì)照外，每孔加入堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶藕聯(lián)的抗前列腺特異抗原與α1-抗糜蛋白酶復(fù)合蛋白抗體結(jié)合物，在室溫下孵育二小時(shí)后，棄去酶聯(lián)板孔液體，洗滌三次，拍干，用不干膠片貼于酶聯(lián)板。

C.顯色反應(yīng)。每孔加入100微升酶底物溶液，放置室溫下觀察顯色反應(yīng)。

D.終止顯色反應(yīng)。每孔加入等量的終止液(2當(dāng)量的硫酸液)

E.光吸收OD值測(cè)定。用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品顯色終止反應(yīng)后的終止OD值，如果用藍(lán)磷作為堿性磷酸酶底物，值用595-650nm波長(zhǎng)來(lái)測(cè)定與堿性磷酸酶抗體結(jié)合物反應(yīng)后的終止OD值；如果用ABTS作為辣根過(guò)氧化物酶底物，用405nm波長(zhǎng)來(lái)測(cè)定與辣根過(guò)氧化物酶抗體結(jié)合物反應(yīng)后OD值。

F.數(shù)據(jù)分析。主要包括一般生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析測(cè)定樣品前列腺特異抗原與α1-抗糜蛋白酶復(fù)合物的濃度，偏差，相關(guān)系數(shù)等。

G.臨床敏感性和特異性分析模型(ROC，Receiver?Operator?Characteristic)分析判斷前列腺病人血清樣品中的群體敏感性和特異性。