[發(fā)明專利]色氨酸合成代謝途徑加強(qiáng)的基因工程菌

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710056966.7
• 申請(qǐng)日: 2007-03-21
• 公開（公告）號(hào): CN101050469A
• 公開（公告）日: 2007-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭長(zhǎng)江;徐琪壽;張緒梅;劉云;吳健全;韋京豫;楊繼軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/63
• 分類號(hào): C12N15/63;C12N15/52;C12N15/53;C12N1/21;C12P13/22
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所
• 代理人: 陸藝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，涉及一種氨基酸合成代謝途徑加強(qiáng)的基因工程菌。

背景技術(shù)

L-色氨酸(tryptophan)，又名β-吲哚-α-氨基丙酸，屬于芳香族氨基酸。L-色氨酸在人和動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝中起重要作用。目前，L-色氨酸作為原料廣泛應(yīng)用于加工配制飼料、保健食品、配方膳、氨基酸片劑和氨基酸注射液等。

L-色氨酸最早生產(chǎn)時(shí)主要依賴于蛋白質(zhì)水解和化學(xué)合成，以后又出現(xiàn)了發(fā)酵法和酶法生產(chǎn)工藝，但是，上述方法存在著工藝繁瑣、成本高或產(chǎn)量不能滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)需求等問題，使國(guó)際氨基酸市場(chǎng)上L-色氨酸價(jià)格長(zhǎng)期居高不下。隨著基因工程技術(shù)方法的產(chǎn)生和發(fā)展，為構(gòu)建高產(chǎn)氨基酸基因工程菌提供了新的機(jī)遇，尤其是近年來第三代基因工程技術(shù)(即代謝途徑工程技術(shù))的出現(xiàn)更進(jìn)一步推動(dòng)了氨基酸基因工程菌研究的發(fā)展。1979年，前蘇聯(lián)首先成功地利用體外構(gòu)建重組質(zhì)粒的基因工程方法選育了高產(chǎn)蘇氨酸生產(chǎn)菌，滿足了工業(yè)化生產(chǎn)蘇氨酸的要求，開創(chuàng)了氨基酸發(fā)酵工業(yè)的新紀(jì)元。自上世紀(jì)80年代中期以來，用體外重組技術(shù)的方法構(gòu)建氨基酸生產(chǎn)菌株的研究在國(guó)外廣泛開展，并取得了不少進(jìn)展。目前，國(guó)內(nèi)尚沒有采用第三代基因工程技術(shù)研究選育色氨酸基因工程菌的專利申請(qǐng)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脫氫酶基因突變體的重組質(zhì)粒。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種色氨酸合成代謝途徑加強(qiáng)的基因工程菌。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種敲除tnaA基因的色氨酸合成代謝途徑加強(qiáng)的基因工程菌。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種敲除tnaA基因的色氨酸合成代謝途徑加強(qiáng)的基因工程菌的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

一種含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脫氫酶基因突變體的重組質(zhì)粒，用下述方法制成：采用pET22b(+)單質(zhì)粒多基因串聯(lián)表達(dá)的策略，將色氨酸合成酶基因trpBA與磷酸甘油酸脫氫酶基因突變體M3serA基因串聯(lián)，得重組質(zhì)粒pET-T7?promotor-M3serA-T7promotor-trpBA-T7?terminator，命名為M3BAT-I。

一種色氨酸合成代謝途徑加強(qiáng)的基因工程菌，用下述方法獲得：以λDE3噬菌體侵染宿主菌Escherichisa?coli?491，使溶源化后的命名為DE3-491的細(xì)菌的染色體上含有一拷貝由lacUV5控制的T7?RNA聚合酶基因，將一種含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脫氫酶基因突變體的重組質(zhì)粒M3BAT-I轉(zhuǎn)入感受態(tài)DE3-491后，成為一種色氨酸合成代謝途徑加強(qiáng)的基因工程菌，命名為M3BAT-I+DE3-491。

一種敲除tnaA基因的色氨酸合成代謝途徑加強(qiáng)的基因工程菌，用下述方法獲得：(1)選取tnaA基因上下游側(cè)翼序列片段與卡那霉素抗性基因kan^r，連接構(gòu)建串聯(lián)基因盒pET22b-tnaA5′-kan^r-tnaA3′，并將線性化片段tnaA5′-kan^r-tnaA3′通過Red同源重組系統(tǒng)替換掉命名為M3BAT-I+DE3-491的一種色氨酸合成代謝途徑加強(qiáng)的基因工程菌染色體上的tnaA基因，導(dǎo)致該基因正常功能的喪失，得到色氨酸酶缺陷株，命名為M3BAT-I+DE3-491ΔT。

一種敲除tnaA基因的色氨酸合成代謝途徑加強(qiáng)的基因工程菌的應(yīng)用，包括下述步驟：將命名為M3BAT-I+DE3-491ΔT的敲除tnaA基因的色氨酸合成代謝途徑加強(qiáng)的基因工程菌按質(zhì)量百分含量為3％-7％比例加入M63培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀達(dá)到1.0后，加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)50-54小時(shí)。

一種色氨酸合成代謝途徑加強(qiáng)的基因工程菌，以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析，M3BAT-I在DE3-491可表達(dá)44kD、37kD、29kD蛋白(圖2)，分別相當(dāng)于色氨酸合成酶β亞基、磷酸甘油酸脫氫酶M3突變體、色氨酸合成酶α亞基。酶活性分析表明，色氨酸合成酶的活性分別比含空載體的對(duì)照菌株提高了3倍左右，磷酸甘油酸脫氫酶總活性提高了約4倍。一種敲除tnaA基因的色氨酸合成代謝途徑加強(qiáng)的基因工程菌培養(yǎng)后，培養(yǎng)上清液色氨酸含量由原來的2mg/L提高到99mg/L。

附圖說明

圖1為本發(fā)明一種含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脫氫酶基因突變體的重組質(zhì)粒(M3BAT-I)構(gòu)建流程圖。