[發(fā)明專利]HCMVPP65抗原血癥間接免疫熒光法檢測試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710056895.0
• 申請日: 2007-03-09
• 公開（公告）號(hào): CN101261272A
• 公開（公告）日: 2008-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙衛(wèi)軍
• 申請（專利權(quán)）人: 天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/577
• 分類號(hào): G01N33/577;G01N21/64;G01N33/531
• 代理公司: 天津盛理知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 王融生

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于特別涉及一種HCMVPP65抗原血癥間接免疫熒光法檢測試劑盒。

背景技術(shù)

國外巨細(xì)胞感染檢測相關(guān)技術(shù)的研究與開發(fā)現(xiàn)狀：盡管病毒殼脫落離心培養(yǎng)技術(shù)得到了極其廣泛的應(yīng)用，但其耗時(shí)較長，結(jié)果受標(biāo)本保存時(shí)間影響大，所以其臨床應(yīng)用價(jià)值尚不明朗。血清學(xué)試驗(yàn)由于只能在感染2～4W后才能檢出陽性結(jié)果，而且受器官移植后免疫抑制劑的影響，不能分辯潛伏性感染和活動(dòng)性感染，其臨床應(yīng)用價(jià)值受到一定的限制。近來，國外報(bào)道了標(biāo)準(zhǔn)化的HCMV分析法有助于預(yù)測HCMV病。抗原血癥檢測技術(shù)是一種更快速、更敏感、早期檢測CMV活動(dòng)性感染的技術(shù)，pp65抗原分析能敏感地在早期預(yù)測HCMV病.在出現(xiàn)臨床癥狀以前，抗原血癥檢測技術(shù)和PCR技術(shù)均可檢測和鑒定出CMV的感染。目前HCMV?pp65抗原血癥檢測試劑盒在國外已有兩家公司商品化，并在美國FDA注冊。在我國已有此方面的診斷技術(shù)引入，但均為進(jìn)口試劑。

國內(nèi)巨細(xì)胞感染檢測相關(guān)技術(shù)的研究與開發(fā)現(xiàn)狀：目前，國內(nèi)對(duì)器官移植患者的感染合并癥，雖然臨床上經(jīng)常遇到，但實(shí)際認(rèn)識(shí)水平大都不高，研究也不多，診斷手段還不全，廣泛使用的還是血清學(xué)診斷方法，不能夠達(dá)到早期診斷地目的。在國內(nèi)采用的同類產(chǎn)品全部是進(jìn)口試劑，而至今在我國尚未有開發(fā)上市的國產(chǎn)試劑，雖有應(yīng)用方面的相關(guān)研究，但國內(nèi)未見研制和生產(chǎn)方面的研究。

我們目前的研究表明，一旦出現(xiàn)CMV感染的臨床癥狀，抗病毒藥物不能控制該病的病理進(jìn)程，這意味著抗病毒藥物必須在CMV感染的臨床癥狀出現(xiàn)前就使用，這就有賴于實(shí)驗(yàn)室的分析來預(yù)測CMV病。本研究前瞻性地研究了白細(xì)胞中CMV陽性細(xì)胞數(shù)量與CMV臨床癥狀之間的關(guān)系，證實(shí)CMV陽性細(xì)胞數(shù)量可以預(yù)測CMV臨床癥狀，其峰值要比CMV感染臨床癥狀出現(xiàn)早1~2個(gè)月。因此我們認(rèn)為使用HCMVpp65抗原血癥間接免疫熒光法檢測白細(xì)胞中CMV陽性細(xì)胞數(shù)量是一個(gè)簡單、快速而敏感的預(yù)測CMV感染的方法。原有的HCMVP65抗原血癥間接免疫熒光法檢測試，制作方法落后，過程復(fù)雜，中間過程控制較難，結(jié)果不理想。特異性與敏感性低。

從巨細(xì)胞pp65單克隆抗體制備的角度，研究了白細(xì)胞中CMV陽性細(xì)胞數(shù)量與CMV臨床癥狀之間的關(guān)系。通過新型抗體組的開發(fā)，提高試劑的敏感度，增加陽性樣本細(xì)胞的著色數(shù)量。此理論基礎(chǔ)已從臨床應(yīng)用中獲得驗(yàn)證，陽性樣本的染色細(xì)胞數(shù)量明顯高于國外試劑。彌補(bǔ)無同類國產(chǎn)試劑空白，臨床評(píng)估證明產(chǎn)品性能已達(dá)國際水平。應(yīng)用pp65抗原血癥檢指導(dǎo)抗病毒藥物的使用進(jìn)行早期性預(yù)排空治療，對(duì)提高器官移植存活率意義重大。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：提供一種HCMVP65抗原血癥間接免疫熒光法檢測試劑。方法先進(jìn)，步驟簡化，結(jié)果理想。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

采用的關(guān)鍵技術(shù)為(1)人巨細(xì)胞病毒1A6與4A8單克隆抗體制備與鑒定。(2)直接裂解紅細(xì)胞技術(shù)。

(1)巨細(xì)胞病毒(CMV)pp65蛋白的單克隆抗體制備基本過程與鑒定

pp65蛋白的單克隆抗體其制作方法為：以巨細(xì)胞病毒-AD169病毒株pp65蛋白為免疫原，免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠的脾細(xì)胞和同系小鼠的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)融合，通過間接ELISA的篩選和有限稀釋克隆化，獲得鼠抗巨細(xì)胞病毒pp65蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，通過ELISA和免疫熒光實(shí)驗(yàn)等方法鑒定其特性；

成功地建立了2株穩(wěn)定分泌pp65蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1A6，和4A8；通過ELISA，免疫熒光實(shí)驗(yàn)等方法的鑒定，抗pp65蛋白的單克隆抗體性能與pp65蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)；免疫熒光實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，pp65蛋白的單克隆抗體性能與以巨細(xì)胞病毒-AD169病毒株pp65蛋白發(fā)生特異性結(jié)合；結(jié)果顯示，C10/C11單克隆抗體--陽性對(duì)照抗體，與待篩選單克隆抗體作用的巨細(xì)胞病毒感染的人胚成纖維細(xì)胞株細(xì)胞的胞核均出現(xiàn)明顯的pp65蛋白熒光反應(yīng)，與小鼠IgG作用不發(fā)生反應(yīng)；由此獲得了特異性識(shí)別抗巨細(xì)胞病毒pp65蛋白單克隆抗體，為人巨細(xì)胞病毒病毒pp65蛋白抗原血癥檢測試劑的研制奠定了基礎(chǔ)；

所需材料與方法

A動(dòng)物

6～8周的Balb/C小鼠，雌性，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供[SCXK(京)2004-002]。

1.2試劑