[發明專利]精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸－N端游離的氨基酸或其衍生物細胞粘附四肽的制備方法

無效

• 申請號: 200710056359.0
• 申請日: 2007-11-28
• 公開（公告）號: CN101161673A
• 公開（公告）日: 2008-04-16
• 發明（設計）人: 徐力;張學忠;黃宜兵;楊森;郭軼
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C07K5/11
• 分類號: C07K5/11;C07K1/00
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司
• 代理人: 張景林;劉喜生

1.精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-N端游離的氨基酸或其衍生物細胞粘附四肽的制備方法，其包括如下步驟：

(1)通過氯乙酰氯與天冬氨酸的反應得到氯乙酰化天冬氨酸；

(2)氯乙酰化天冬氨酸與乙酸酐反應得到氯乙酰化天冬氨酸內酸酐；

(3)氯乙酰化天冬氨酸內酸酐與N端游離的氨基酸或其衍生物反應得到氯乙酰化天冬氨酸-AA，AA代表N端游離的氨基酸或其衍生物；

(4)氯乙酰化天冬氨酸-AA氨解得到甘氨酸-天冬氨酸-AA三肽；

(5)芐氧羰基精氨酸與三溴化磷反應得到氮羧基內酸酐精氨酸；

(6)氮羧基內酸酐精氨酸與甘氨酸-天冬氨酸-AA三肽反應得到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-AA四肽。

2.如權利要求1所述的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-N端游離的氨基酸或其衍生物細胞粘附四肽的制備方法，其特征在于：取25～35克L-天冬氨酸懸浮于40～60毫升、質量濃度為17％～27％的氫氧化鈉水溶液中使其完全溶解，調pH值8～12之間，然后加入30～60毫升乙酸乙酯；在0℃～10℃的條件下，以0.12～0.20ml/min的速度分別滴加15～30毫升、10～13mol/L氯乙酰氯和15～40毫升17％～27％氫氧化鈉到上述溶液中，邊滴加邊攪拌，滴加過程中保持溶液的pH在8～12范圍內，滴加完畢，繼續攪拌20～50分鐘；結束反應時用濃鹽酸調pH至3以下，然后將此反應液用乙酸乙酯抽提三次，合并提取液，加無水硫酸鈉干燥，減壓除去乙酸乙酯，即得到氯乙酰化天冬氨酸白色粉末。

3.如權利要求1所述的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-N端游離的氨基酸或其衍生物細胞粘附四肽的制備方法，其特征在于：將10～20克氯乙酰化天冬氨酸加入10～20毫升、10～11mol/L乙酸酐，在35℃～42℃空氣浴加熱下防潮攪拌3～4小時，再加入3～5毫升乙酸酐攪拌3～4小時，冷卻至室溫固化，加入40～60ml乙醚和10～20ml石油醚研碎，過濾，經200～500ml、體積比為4∶1的乙醚-石油醚洗滌后干燥，得氯乙酰化天冬氨酸內酸酐。

4.如權利要求1所述的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-N端游離的氨基酸或其衍生物細胞粘附四肽的制備方法，其特征在于：將氯乙酰化天冬氨酸內酸酐溶于乙腈中，濃度為1g∶10～20ml；將N端游離的氨基酸或其衍生物溶于0.1～0.5mol/L碳酸鉀水溶液中，濃度為1g∶1～10ml，用碳酸鉀水溶液調pH值為8～12之間，氯乙酰化天冬氨酸內酸酐與N端游離的氨基酸或其衍生物的摩爾比為1∶1，在0～10℃的條件下，在0.1～0.2ml/min速度下緩緩滴入氯乙酰化天冬氨酸內酸酐乙腈溶液，保持pH為8～12之間，滴完后繼續攪拌30～60分鐘；結束反應時用濃鹽酸調PH至3以下，將此反應液用乙酸乙酯抽提三次，將水層除鹽后凍干，得到氯乙酰化天冬氨酸-AA。

5.如權利要求4所述的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-N端游離的氨基酸或其衍生物細胞粘附四肽的制備方法，其特征在于：N端游離的氨基酸為絲氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、胱氨酸或苯丙氨酸。

6.如權利要求5所述的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-N端游離的氨基酸或其衍生物細胞粘附四肽的制備方法，其特征在于：N端游離的氨基酸為絲氨酸。

7.如權利要求1所述的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-N端游離的氨基酸或其衍生物細胞粘附四肽的制備方法，其特征在于：在0℃～10℃下，將前面所得的氯乙酰化天冬氨酸-AA按照1g∶5～10ml的比例加入濃度為25％～28％的濃氨水，攪拌24～48小時，然后減壓除去多余氨氣，旋轉蒸發得到微黃粘稠狀物質，加入乙醇振搖并倒掉，再加入乙醇攪拌至成粉末，旋轉蒸發即得甘氨酸-天冬氨酸-AA三肽白色粉末。

8.如權利要求1所述的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-N端游離的氨基酸或其衍生物細胞粘附四肽的制備方法，其特征在于：于20ml～200ml四氫呋喃溶液中懸浮1g～10g的芐氧羰基精氨酸，于室溫加入5ml～50ml含有三溴化磷的四氫呋喃溶液，V三溴化磷∶V四氫呋喃＝1∶4，室溫攪拌3～5小時，將反應液下層沉淀下來的比重比較大的油狀物反復用200～400ml的四氫呋喃洗滌，真空干躁得淡黃色的焦油狀物，即氮羧基內酸酐精氨酸。

9.如權利要求1所述的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-N端游離的氨基酸或其衍生物細胞粘附四肽的制備方法，其特征在于：在帶有溫度計、pH電極、外冷卻裝置和攪拌裝置的容器中，將甘氨酸-天冬氨酸-AA三肽溶于pH?8～12的0.1～0.3mol/L的硼酸-硼酸鉀緩沖體系中，體系中甘氨酸-天冬氨酸-AA三肽的含量是0.5～0.8mol/L，用KOH調pH值為8～12，加入0.01～0.03毫升辛醇，在激烈攪拌下一次加入氮羧基內酸酐精氨酸，氮羧基內酸酐精氨酸與甘氨酸-天冬氨酸-AA三肽的摩爾比為1～1.5∶1，并不斷加入1～2mol/L的KOH溶液保持pH為8～12，3～5分種內堿消耗結束后加入濃硫酸調pH到3以下終止反應；反應液凍干，用少量水溶解，用乙醇沉淀此液，抽濾得沉淀，用SephadexG-10柱層析分離產物，得到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-AA四肽產品。