[發明專利]抑制人類細胞周期蛋白A2表達的siRNA及其應用

無效

• 申請號: 200710056308.8
• 申請日: 2007-11-13
• 公開（公告）號: CN101328199A
• 公開（公告）日: 2008-12-24
• 發明（設計）人: 曲曉剛;王曉輝
• 申請（專利權）人: 中國科學院長春應用化學研究所
• 主分類號: C07H21/02
• 分類號: C07H21/02;A61K48/00;A61K31/7088;A61P35/00
• 代理公司: 長春科宇專利代理有限責任公司
• 代理人: 馬守忠

技術領域

本發明屬于生物技術和生物醫學領域。本發明涉及特異性抑制人類細胞周期蛋白A₂(cyclin?A₂)的siRNA及其應用。

背景技術

RNA干擾(RNA?interfering，RNAi)是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA引發的廣泛存在于生物體內的序列特異性基因轉錄后的沉默過程。RNAi首先由Andrew?Fire等于1998年首先在秀麗線蟲中發現，隨后被廣泛發現于真菌、擬南芥、水螅、渦蟲、錐蟲、斑馬魚等大多數真核生物中。Elbashir?SM等于2001年利用人工合成小分子雙鏈RNA在哺乳細胞中發揮RNAi作用，自此以后，RNAi成為分子醫學強有力的工具。

人類細胞周期蛋白A₂是細胞周期蛋白家族的一員，參與G1/S期和G2/M期轉換，在DNA復制、轉錄過程中發揮重要的作用。過高的人類細胞周期蛋白A₂表達水平導致S其缺陷和染色體的不穩定，其表達水平失常參與腫瘤轉化和腫瘤發生的過程。在星形細胞瘤、乳腺癌、子宮頸癌、結腸癌、胃癌、白血病、肝癌、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、睪丸癌等都發現人類細胞周期蛋白A₂過量表達，且其高表達水平是肝癌、非小細胞肺癌、頭頸癌、胃癌、白血病等的不良預后的標志。因此下調或抑制人類細胞周期蛋白A₂是腫瘤治療的一種有效手段。

發明內容

本發明的目的是提供異性抑制人類細胞周期蛋白A₂的siRNA及其應用。

本發明的第一方面中，提供特異性抑制人類細胞周期蛋白A₂的siRNA，所述的siRNA對應的靶序列是人類細胞周期蛋白A₂的mRNA，所述的siRNA長度為16-30bp，含有如下所示的核酸序列：

5’-CCA?UUG?GUC?CCU?CUU?GAU?UTT-3’

5’-AAU?CAA?GAG?GGA?CCAAUG?GTT-3’??(SEQ?ID?NO：1)；

較佳地，所述的siRNA的3’端含有2-4個dT或2-6個U的延伸結構；

所述的siRNA以己二胺功能化的碳納米管為載體，經轉染使K562細胞的人類細胞周期蛋白A₂的mRNA表達水平下降60-95％。

本發明的第二方面涉及所述的siRNA的應用，所述的siRNA用于制備抑制細胞增殖、促進細胞凋亡的治療腫瘤的藥物。所述的siRNA作為該藥物的活性成分，其質量含量為0.001-99.999％。

如附圖所示，將如上所述的siRNA轉入K562細胞，用RT-PCR和免疫印跡檢測其對人類細胞周期蛋白A₂表達的抑制，用苔酚藍拒染法計數和軟瓊脂克隆形成實驗檢測其對細胞增值的影響，用流式細胞儀檢測亞二倍體峰(subGlpeak)和DNA?ladder?gel電泳檢測凋亡DNA片段來觀察其對細胞凋亡的影響。結果表明：RT-PCR和免疫印跡實驗顯示如上所述的siRNA能特異性抑制人類細胞周期蛋白A₂的表達，抑制效率在70％以上；苔酚藍計數顯示如上所述的siRNA能顯著抑制細胞生長；軟瓊脂克隆形成實驗顯示如上所述的siRNA能顯著抑制細胞增值；流式細胞檢測亞二倍體峰實驗和DNA?ladder?gel電泳實驗顯示上所述的siRNA能促進細胞凋亡。

附圖說明

圖1：RT-PCR檢測本發明所述siRNA對人類細胞周期蛋白A₂?mRNA表達水平的影響圖。

圖2：免疫印跡檢測本發明所述siRNA對人類細胞周期蛋白A₂蛋白表達水平的影響圖。

圖3：苔酚藍拒染細胞計數檢測本發明所述siRNA對腫瘤細胞生長的影響圖。

圖4：軟瓊脂克隆形成實驗檢測本發明所述siRNA對腫瘤細胞增殖的影響圖。

圖5：流式細胞儀檢測本發明所述siRNA對腫瘤細胞凋亡的影響圖。

圖6：DNAladder?gel電泳檢測本發明所述siRNA對細胞凋亡的影響圖。

具體實施方式

實施例1：siRNA的合成

本發明施例中的針對人類細胞周期蛋白A₂的siRNA是根據Elbashir?userguider原則設計，針對人類細胞周期蛋白A₂?mRNA的524-544位點選取的一段21bp的siRNA，其序列如下所示：