[發明專利]布魯氏菌分子標記和毒力缺失弱毒疫苗及制備方法

無效

• 申請號: 200710056007.5
• 申請日: 2007-08-29
• 公開（公告）號: CN101185756A
• 公開（公告）日: 2008-05-28
• 發明（設計）人: 閆廣謀;王興龍
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所
• 主分類號: A61K39/10
• 分類號: A61K39/10;A61P31/04;C12N1/21;C12N15/09
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司
• 代理人: 陳宏偉

1.一種可區分自然感染或野毒感染的布魯氏菌弱毒疫苗ΔS19-1，特征在于：布魯氏菌需弱毒疫苗株S19的Bp26基因缺失而成ΔS19-1。

2.根據權利要求1所述的布魯氏菌弱毒疫苗ΔS19-2，特征在于：ΔS19-1毒力基因Bmp18缺失而成弱毒疫苗株ΔS19-2。

3.根據權利要求1或2限定的疫苗制備方法，其特征在于：根據布魯氏菌基因組序列，設計PCR引物，擴增出分子目標基因Bp26同源重組的引導序列，在T載體上對其進行改造，在它的中間用限制性內切酶去除其中的500bp，在這個位置上連接上Luc?NF+基因，破壞了Bp26的原有序列，然后把改造好的基因片段連入自殺性的質粒上pBLs。

4.根據權利要求3限定的疫苗制備方法，其特征在于：主要包括以下步驟：

(1)以布魯氏菌弱毒疫苗基因組為模板，設計引物，用PCR的方法，擴增出分子標記目標基因的同源重組引導序列，而后克隆到T載體上對目標基因改造；

(2)用(1)得到的基因片段與復制啟動子為pUC?oir的載體相連，而后將sacB基因連接到這個載體的適當位置，構建成同源重組載體(自殺性質粒)；

(3)使步驟(2)得到的重組載體轉化到布魯氏菌中去；利用同源重組載體自帶的篩選標記篩出同源重組單交換子，利用sacB基因篩選出同源重組的雙交換子，得到本發明的分子標記疫苗株ΔS19-1；

(4)重新設計引物，從布魯氏菌基因組中，擴增出目標毒力基因的同源重組引導序列，使用(1)～(3)的方法使ΔS19-1的毒力缺失，得到本發明的分子標記、毒力缺失弱毒疫苗株ΔS19-2。

5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于：所說的弱毒疫苗株為S19。

6.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于：所說的分子標記目標基因為Bp26。

7.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于：所說的分子標記目標基因是指用限制性內切酶切除其中500bp，而后在這個位置上連接上Luc?NF+報告基因。

8.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于：所說目標蛋白是BP26蛋白。

9.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于：所說的目標毒力基因是Bmp18基因。

10.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于：所說目標毒力基因改造是指用限制性內切酶切除其中的200bp，而后使之相聯。