[發明專利]一種具有大豆MnSOD基因的粟酒裂殖酵母工程菌及其構建方法

無效

• 申請號: 200710055952.3
• 申請日: 2007-08-03
• 公開（公告）號: CN101157897A
• 公開（公告）日: 2008-04-09
• 發明（設計）人: 王丕武;萬麗娜;付永平
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/53;C12N15/87
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司
• 代理人: 魏征驥

技術領域

本發明涉及一種具有大豆MnSOD基因的粟酒裂殖酵母工程菌及其構建方法

背景技術

對SOD的研究起始于1938年。1938年英國T.mann和D.keilin最早從牛血液中分離出含銅的蘭綠色蛋白，當時稱血銅蛋白。1953年從馬肝中分離出類似蛋白稱肝銅蛋白，后來又從腦中分離出這種蛋白稱腦銅蛋白。

1969年Mccord和Fridovich發現該蛋白有催化O₂，發生歧化反應的功能，故將此酶命名為超氧化物歧化酶(Superoxide?Dismutase，SOD，EC1.15.1.1)。

超氧化物歧化酶(Superoxide?dismutase，SOD)是生物體防御氧化損傷的一種十分重要的生物酶，能夠催化超氧陰離子(O^2-)發生歧化反應，從而專一的清除生物體內的超氧陰離子，平衡機體的氧自由基，較好地抵御氧自由基和其他氧化物自由基對細胞質膜的毒性。

在高等植物中，SOD根據其輔基部位結合的不同金屬離子分為三類：MnSOD、FeSOD、CuZnSOD。在植物中CuZnSOD是三種超氧化物歧化酶中含量最豐富的一類，主要存在于葉綠體、胞質和過氧化物酶體中。MnSOD和FeSOD每個亞基都只含有一個金屬離子，MnSOD主要存在于線粒體中，而FeSOD存在于葉綠體中。

MnSOD的催化活性不受其產物H₂O₂的抑制。線粒體是真核生物細胞進行有氧呼吸的主要場所，通過其內膜的電子傳遞鏈實現能量轉換的功能；當生物處于脅迫或病變條件下，線粒體內膜電子傳遞受阻，將導致活性氧過量產生，對線粒體乃致整個細胞造成傷害。因此MnSOD是細胞線粒體內消除超氧陰離子、保護線粒體不受活性氧傷害的關鍵酶。

MnSOD是人體內除CuZnSOD之外的另一種SOD，與CuZnSOD相比具有壽命長、分子量小等優點，而且錳的毒性較之銅鐵為低，其小分子配合物作為模擬MnSOD安全性好。因而近年來有關MnSOD的研究非常活躍。

在SOD家族中MnSOD的特點是：生物半衰期較長，抗炎抗輻射作用優于CuZnSOD，這表明MnSOD作為酶制劑具有十分重要的醫用價值和潛在的臨床應用前景。

由于MnSOD僅存于線粒體中，含量甚微，用傳統的生物化學方法難以從天然組織中分離純化較大量的MnSOD蛋白，因此采用分子克隆的方法獲得MnSOD的基因序列，并通過轉基因的方法使MnSOD基因在酵母中大量表達是深入研究其功能的重要途徑。

酵母菌是單細胞真核生物，具有生長快，易于遺傳操作、能對外源蛋白進行翻譯后加工和修飾、不產生有毒產物等特點，被認為是表達外源蛋白的合適宿主。

裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)細胞橢圓形、圓柱形，由營養細胞接合，形成子囊。有發酵能力，代表種為粟酒裂殖酵母，最早分離自非洲粟米酒，能使菊芋發酵產生酒精。粟酒裂殖酵母(fission?yeast或Schizosaccharomyces?pombe)是一種簡單的單細胞生物，其基因組為14Mb，大約是大腸桿菌基因組的4倍。該酵母區別于同屬于子囊真菌的釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)，許多研究表明兩種酵母在系統分類、細胞周期、rRNA的生物合成和基因的組織、結構及基因的表達調控等方面并不相同，在某些方面裂殖酵母與高等動物卻有一定的相似性，因此，裂殖酵母也是一種良好的研究真核生物的模式生物。

發明內容

本發明提供一種具有大豆MnSOD基因的粟酒裂殖酵母工程菌及其構建方法。

本發明采取的技術方案是：將構建的含有大豆MnSOD基因的重組粟酒裂殖酵母表達載體導入粟酒裂殖酵母中得到的。

本發明將MnSOD基因插入到粟酒裂殖酵母表達載體的多克隆位點處，將構建的該重組粟酒裂殖酵母表達載體pESPUC-MnSOD導入粟酒裂殖酵母中，獲得重組粟酒裂殖酵母轉化子，培養重組粟酒裂殖酵母使MnSOD基因得到表達。

本發明重組粟酒裂殖酵母表達載體pESPUC-MnSOD，該載體含有Pnmt1啟動子、Pnmt1終止子序列，抗性基因為氨芐青霉素，選擇標記基因LEU，大豆MnSOD基因位于多克隆酶切位點SalI和BamHI之間。

本發明大豆MnSOD基因分別為SEQ?ID?NO.1，SEQ?ID?NO.2，SEQ?ID?NO.3所述。

本發明酵母轉化方法是醋酸鋰轉化法及電擊轉化法。

本發明中IPTG能誘導MnSOD基因在粟酒裂殖酵母中大量表達。