[發(fā)明專利]動(dòng)物布魯氏菌抗體膠體金試紙膜檢測(cè)試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710055740.5
• 申請(qǐng)日: 2007-06-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101055273A
• 公開(kāi)（公告）日: 2007-10-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王興龍;李曉艷;唐景峰;梅建軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): G01N33/569
• 分類號(hào): G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 吉林長(zhǎng)春新紀(jì)元專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 陳宏偉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明公開(kāi)一種動(dòng)物布魯氏菌抗體膠體金試紙膜檢測(cè)試劑盒，用于布 魯氏菌病的診斷，屬于動(dòng)物疫病診斷技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

布魯氏菌是一種革蘭氏陰性、特異性胞內(nèi)寄生菌，能感染多種動(dòng)物和 人。目前，根據(jù)致病性及宿主的不同將布魯氏菌分成6個(gè)種，即羊布魯氏 菌、牛布魯氏菌、豬布魯氏菌、沙林鼠布魯氏菌、綿羊布魯氏菌、犬布魯 氏菌。其中在世界范圍內(nèi)廣泛流行的是牛、羊、豬布魯氏菌，對(duì)畜牧業(yè)危 害巨大，更重要的是它們均能引起人的感染，威脅著公眾健康。所以對(duì)布 魯氏菌病診斷方面的研究一直受到世界各國(guó)的關(guān)注。傳統(tǒng)的診斷動(dòng)物布魯 氏菌病的血清學(xué)診斷方法包括：快速滑動(dòng)凝集試驗(yàn)(RSAT)、標(biāo)準(zhǔn)試管凝 集試驗(yàn)(SAT)、2-巰基乙醇試管凝集試驗(yàn)(2ME)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT) 等。它們都存在著以下不足，首先，與其它細(xì)菌(如：耶爾森氏菌O9、大 腸桿菌O157)發(fā)生交叉反應(yīng)現(xiàn)象很難避免；第二，傳統(tǒng)診斷方法費(fèi)時(shí)、費(fèi) 力且易出現(xiàn)假陽(yáng)性；第三，傳統(tǒng)的診斷方法不能區(qū)分布魯氏菌病的病原種 型。因此，建立一種簡(jiǎn)便、快速、特異的診斷方法，對(duì)于動(dòng)物布魯氏菌病 的診斷、檢疫和流行病學(xué)調(diào)查具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明公開(kāi)一種動(dòng)物布魯氏菌抗體膠體金試紙膜檢測(cè)試劑盒，該試劑 盒可以檢測(cè)牛、羊、豬布魯氏菌抗體，與傳統(tǒng)的血清學(xué)方法比，更簡(jiǎn)便、 快速、特異。適用于動(dòng)物布魯氏菌病的診斷、檢疫和流行病學(xué)調(diào)查。

本發(fā)明的解決方案是根據(jù)抗原、抗體能特異結(jié)合的免疫學(xué)原理，利用 膠體金免疫層析技術(shù)和銀染加強(qiáng)技術(shù)，以重組的金黃色葡萄球菌A蛋白 (SPA)作為金標(biāo)蛋白，以高純度的布魯氏菌LPS作為包被抗原，利用羊 抗牛IgG為質(zhì)控線制備膠體金試紙膜。本試驗(yàn)試劑盒包括膠體金試紙膜， 陰、陽(yáng)性試劑，塑料吸管離心管以及說(shuō)明書(shū)。

試劑盒的具體制作方法

用熱酚法和冷酚法提取牛布魯氏菌544A和羊布魯氏菌16M的LPS， 經(jīng)Sephadex?G-50層析柱純化后，LPS的含量為1.21～2.31mg/mL，瓊擴(kuò)試 驗(yàn)表明該抗原能與相應(yīng)的抗體發(fā)生反應(yīng)，且不發(fā)生種內(nèi)交叉。利用純化的 LPS作為檢測(cè)線包被抗原，用重組金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)作為金 標(biāo)蛋白，根據(jù)膠體金免疫層析法的基本原理組裝成試紙膜。研究結(jié)果表明， 牛、羊、豬動(dòng)物布魯氏菌抗體檢測(cè)試紙最低檢測(cè)蛋白量分別為1μg/mL、 2μg/mL，不與大腸桿菌O157，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O9、沙門(mén)氏菌、胸膜 肺炎放線菌的陽(yáng)性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，4℃保存期為12個(gè)月。20份布魯氏 菌陽(yáng)性血清用PBS1:1稀釋之后，用本實(shí)驗(yàn)組裝的試紙進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果19 份為陽(yáng)性，符合率為95％。18份布魯氏菌樣本血清，分別用平板凝集試驗(yàn) (PAT)和試紙進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果陰性、陽(yáng)性符合率均為100％。

試劑盒由以下結(jié)構(gòu)組成：

(1)試紙膜：

①樣品墊：緊密連接于試紙的金標(biāo)墊，是試紙進(jìn)行檢測(cè)的部分。主要 接觸樣品液，利用樣品墊的吸附使液體前進(jìn)，但液面不能超過(guò)樣品墊的 MAX線。

②玻璃纖維膜：位于樣品墊的上部，是金標(biāo)蛋白固定的材料。布魯氏 菌抗體試紙的玻璃纖維吸附有金標(biāo)探針，即所謂的金標(biāo)墊。金標(biāo)探針是由 膠體金標(biāo)記重組金黃色葡萄菌A蛋白而成，可特異性的吸附布魯氏菌抗體。

③硝酸纖維膜(NC)：位于玻璃纖維膜的上部，膜上有檢測(cè)線(T)和 質(zhì)控線(C)。布魯氏菌抗體膠體金試紙的T線包被布魯氏菌特異的LPS， C線包被羊抗牛IgG。

④吸水紙：位于試紙的最上部，緊連著NC膜。試紙吸附樣品液的動(dòng)力 主要靠吸水紙和樣品墊。

⑤塑料墊板：主要起支撐試紙的作用，為硬質(zhì)塑料板。

(2)陰、陽(yáng)性試劑：

①陰性試劑：試劑盒使用時(shí)，作為陰性對(duì)照。

②陽(yáng)性試劑：試劑盒使用時(shí)，作為陽(yáng)性對(duì)照。

(3)塑料吸管：主要用于布魯氏菌病樣本的采集。

(4)離心管：主要用于分離樣本時(shí)離心使用。

(5)說(shuō)明書(shū)：主要介紹試劑盒的使用方法。

以下是抗體試紙膜的使用方法：