[發(fā)明專利]以無血培養(yǎng)基制備A群鏈球菌制劑的方法及無血培養(yǎng)基

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710055727.X
• 申請(qǐng)日: 2007-06-06
• 公開（公告）號(hào): CN101096647A
• 公開（公告）日: 2008-01-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邱芳萍;吳戰(zhàn)宇;盧日峰;郎維
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 長春工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12R1/46
• 代理公司: 長春市四環(huán)專利事務(wù)所
• 代理人: 張建成

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，涉及一種利用無血培養(yǎng)基代替血培養(yǎng)基制備A群鏈球菌制劑的方法，特別涉及一種以無血培養(yǎng)基制備A群鏈球菌制劑的方法及無血培養(yǎng)基。

背景技術(shù)

A群鏈球菌制劑又稱OK-432，屬于生物治療藥物，是A群鏈球菌弱毒株經(jīng)培養(yǎng)、擴(kuò)增、青霉素處理后制成的凍干品，已應(yīng)用于臨床治療，如癌性胸腹水及惡性腫瘤的免疫治療等，其性能穩(wěn)定且抗癌療效顯著。但由于傳統(tǒng)制備工藝中常用含血及血漿培養(yǎng)基，使該制劑成本相對(duì)較高，并且容易帶入異源性物質(zhì)，增加熱源物質(zhì)含量，注射給藥易引起患者的過敏反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種以無血培養(yǎng)基制備A群鏈球菌制劑的方法。

本發(fā)明的另一目的是提供一種無血培養(yǎng)基。

以無血培養(yǎng)基制備A群鏈球菌制劑的方法如下：

該方法包括以下步驟：

(1)、無血培養(yǎng)基的準(zhǔn)備：對(duì)無血培養(yǎng)基在4500r/min的條件下離心30min、抽濾，以保證培養(yǎng)基澄清無雜質(zhì)，然后滅菌待用；

(2)、傳代：在無菌室內(nèi)開啟A群鏈球菌弱毒株工作種子批，在斜面培養(yǎng)基上在37℃的條件下，培養(yǎng)20小時(shí)傳三代，然后分別接種在無血培養(yǎng)基，在37℃、120r/min的條件下振蕩培養(yǎng)20小時(shí)制備種子液，在傳代前要進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌則廢棄；

(3)、制備A群鏈球菌制劑；將制好的生產(chǎn)用種子液接種在無血培養(yǎng)基中，在37℃、140r/min的條件下振蕩培養(yǎng)20小時(shí)，在接種前要進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌則廢棄；

(4)、菌體滅活：將青霉素和過氧化氫加入培養(yǎng)物內(nèi)滅活，經(jīng)過振蕩、45℃水浴30min，4500r/min離心30min；

(5)、產(chǎn)品收集：經(jīng)過菌體滅活后的培養(yǎng)物用生理鹽水懸浮，二次離心后將沉淀物在-37℃凍干72小時(shí)得到白色菌體干粉制劑即A群鏈球菌制劑，稱重后密封保存于無菌瓶中。其中的青霉素由華北制藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn)制造；所使用的A群鏈球菌為A群鏈球菌ATCC19615，由吉林省疾病防止控制中心提供；A群鏈球菌弱毒株工作種子批由吉林大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)研究所提供。

上述步驟中：

滅菌所用的設(shè)備為YXQ-SG41-280高壓滅菌鍋，由上海醫(yī)用核子儀器廠生產(chǎn)制造；

離心所用的設(shè)備為RC-3BPLUS低速大容量冷凍離心機(jī)，由美國Du?Pont公司生產(chǎn)制造。

振蕩所用的設(shè)備為HZQ-Q全溫振蕩器，由哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)制造；

水浴所用的設(shè)備為DK-89-I電子恒溫水浴鍋，由天津市斯泰特一起有限公司生產(chǎn)制造；

凍干所用的設(shè)備為Lyolab3000冷凍干燥機(jī)，由丹麥生產(chǎn)制造；

鏡檢所用的設(shè)備為HK光電顯微鏡，由臺(tái)灣OLYMPUS公司生產(chǎn)制造。

無血培養(yǎng)基

無血培養(yǎng)基的優(yōu)化：

重點(diǎn)考察培養(yǎng)基氮源、碳源和能源對(duì)菌體生物產(chǎn)量的影響，選擇胰蛋白胨、葡萄糖和酵母粉含量為考察因素，以生物產(chǎn)量為試驗(yàn)指標(biāo)，設(shè)計(jì)均勻?qū)嶒?yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行偏最小二乘回歸建模確定最佳配比。

經(jīng)過回歸分析可得出最佳培養(yǎng)基重量配比為：胰蛋白胨1.2％、葡萄糖0.9％、酵母粉0.4％、氯化鈉0.5％、磷酸二氫鉀0.5％、其余為水；pH值為7.4～7.6。其中的胰蛋白胨及酵母粉由英國OXID公司生產(chǎn)制造。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表1所示。

表1優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果