[發明專利]硫酸鹽還原菌純菌種的分離及純化新方法

無效

• 申請號: 200710055389.X
• 申請日: 2007-03-09
• 公開（公告）號: CN101050438A
• 公開（公告）日: 2007-10-10
• 發明（設計）人: 方世杰;劉耀輝;王強;蔣磊;于思榮
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司
• 代理人: 朱世林

技術領域：

本發明涉及對硫酸鹽還原菌這種非嚴格厭氧菌進行分離及提純的一種新方法，本方法定名為平板噴霧分離法。此方法采用API固體培養基培養，主要用于提取硫酸鹽還原菌純菌種，并從多個純菌種菌株中挑選出生物活性最強的菌株。此法也可推廣到其它耐氧型、兼氧型和非嚴格厭氧型細菌純菌種的提取，但不適合嚴格厭氧菌。

背景技術

細菌純菌種的分離及純化是指將混雜在一起的不同種類的微生物分離開來以得到生產和研究所需要的單一菌種，這需要特殊的分離方法。微生物純菌種的提取是微生物工業應用和研究的關鍵技術，廣泛地應用于微生物防腐、污水處理、礦物提冶、食品工業、醫藥品生產等領域。傳統上，細菌純菌種的分離及純化主要采用十倍稀釋分離法、平板劃線法、倒平板和平板涂布法、穿刺分離法、單細胞分離法和超微膜分離法等。但是這些方法往往涉及工藝精細、程序繁瑣、尤其要求操作人員有相當高的、熟練的操作水平，給微生物純菌種的提取造成很大的困難和不便。目前，針對硫酸鹽還原菌分離和純化的通用方法采用的是穿刺分離法：即用注射器抽取雜菌菌液，將針頭刺入固體培養基中一定深度，注射菌液，然后延原路拔出針頭，然后加液體石蠟對培養基進行厭氧密封，固體培養基在厭氧環境中進行恒溫培養，最終在沿針頭的部位長出單個的純培養菌落。這種方法操作難度大，往往需要控制好固體培養基中的瓊脂含量、注射菌液數量，還要創造厭氧環境，且挑取單個菌落非常困難，提取成功率極低。此種方法是基于傳統上對硫酸鹽還原菌的生理特性的誤解而產生的，早期通常認為硫酸鹽還原菌是嚴格厭氧菌，但近期的文獻表明，硫酸鹽還原菌有較強的耐氧能力，能夠在空氣中進行正常的生命活動。

技術內容

本發明的目的在于提供一種菌種提取準確、方法簡便易行、成功率高的硫酸鹽還原菌純菌種的分離及純化新方法。

本項發明的技術路線是：在保證快速、準確、簡便地獲得硫酸樣還原菌的單個純培養菌落的前提下，采用平皿固體培養基作為細菌生長的載體，用帶針頭的注射器將菌液以霧狀噴濺在培養基的表面，以獲得單個的細菌附著在培養基表面，經恒溫恒濕無菌環境下培養，獲得有單個細菌繁殖的菌落，然后挑取單個菌落放入液體培養基中繁殖，最終獲得大量的、生物活性良好的，單一硫酸鹽還原菌的純菌種。具體技術方按是：

一種硫酸鹽還原菌純菌種的分離及純化新方法，是在有氧環境下提取和培養出硫酸鹽還原菌純菌種并以挑選出生命活性最強的純化菌種作為二次分離及純化的菌種，具體工藝步驟如下：

a)將選用的硫酸鹽還原菌專性液體培養基，在無菌環境中加熱至即將沸騰時，加入適量瓊脂后攪拌均勻，然后冷凝為固態；

b)在無菌環境中，首先將裝上針頭的無菌注射器進行含菌處理后抽取一段空氣，然后將含菌空氣以霧狀均勻噴射到固體培養基的表面，在恒溫培養箱中培養出菌落，在其中挑取單個菌落，放入滅菌的液體培養基中培養出活性最好的硫酸鹽還原菌純化菌種；

c)以硫酸鹽還原菌純化菌種為菌種，再按菌種的一次分離及純化步驟重復進行一次分離及純化，所得的液體培養基即是所要獲得的硫酸鹽還原菌的純菌種。

所說的硫酸鹽還原菌專性液體培養基按成分稱量、配制、并調節PH值到中性略呈微堿性后，裝入經滅菌處理的錐形瓶中加熱；所說的冷凝過程是在無菌環境中，將含瓊脂的培養基趁熱加入到平皿中，加入量不超過平皿深度的1/3，然后冷卻凝固為待用的固體培養基。

所說的裝上針頭的無菌注射器進行含菌處理是：用無菌注射器并裝上針頭，從含有雜菌的硫酸鹽還原菌菌種中抽取適量菌液，然后再將菌液注射回菌種瓶中，排空菌液，使注射器和針管被硫酸鹽還原菌污染。

所說的恒溫培養箱中溫度約37℃。

是所說的滅菌的液體培養基為在培養基中加入滅菌的硫酸亞鐵銨和抗壞血酸。

本發明提供方法直接對固體培養基表面進行菌液噴霧附著，直接在有氧環境中進行操作和培養，結果表明此方法菌種提取準確、方法簡便易行、成功率極高。

附圖說明

圖1采用平板噴霧分離法和傳統的穿刺分離法獲得的菌落的對比。

圖2透射電鏡下的硫酸鹽還原菌的形貌。

具體實施方式

下面結合實例進一步說明本發明的具體內容及其實施方式。

1.分離及純化所需的設備和原材料

設備及器皿：潔凈工作臺、恒溫培養箱、高溫高壓滅菌鍋、電爐、加熱用石棉墊、培養皿、接種針，玻璃棒，酒精燈，2ml注射器及針頭。

材料：美國石油協會(API)推薦的SRB專用培養基，瓊脂粉，含雜菌的硫酸鹽還原菌菌種。