[發(fā)明專利]一步法制備基因重組人源銅、鋅超氧化歧化酶工藝

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710055369.2
• 申請(qǐng)日: 2007-02-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101245342A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-08-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李廷生;冀清發(fā);于振賢;孫非;遲春萍;關(guān)曉峰;韋博;孫彪;朗寶輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四平華科生物技術(shù)有限責(zé)任公司
• 主分類號(hào): C12N9/08
• 分類號(hào): C12N9/08;C12N1/21
• 代理公司: 四平市新時(shí)代專利事務(wù)所
• 代理人: 孫國(guó)振

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物工程中酶化學(xué)，更具體地說(shuō)，它是應(yīng)用一步法制備基因重組人源銅、鋅超氧化歧化酶工藝。

背景技術(shù)

超氧化物歧化酶(Superoxide?dismutase)簡(jiǎn)稱SOD，是一種含金屬離子的新型酶制劑，廣泛分布于各種生物體內(nèi)，幾乎從動(dòng)物到植物，都有它的存在。被國(guó)際公認(rèn)為是清除氧化自由基(也稱游離基)的特效的酶，人體在正常的新陳代謝或各種激情況下，會(huì)產(chǎn)生大量有氧元素的自由基，稱為超氧自由基。超氧自由基在人體的過(guò)度聚集能加速細(xì)胞的衰老和降低機(jī)體的免疫功能，甚至誘發(fā)腫瘤。SOD則能促使超氧自由基分解，因?yàn)樽鳛橛泻ξ镔|(zhì)的超氧陰離子在SOD的作用下和氫離子反應(yīng)，生成另一種物質(zhì)——過(guò)氧化氫；過(guò)氧化氫又在過(guò)氧化氫酶的作用下和氫離子反應(yīng)，最終生成了一種對(duì)人體無(wú)害的物質(zhì)——水，從而消除其對(duì)人體的損害，它在一定程度上有防止腫瘤發(fā)生、抗衰老、提高機(jī)體免疫力的作用，因而被用于某些急性炎癥、自身免疫性疾病、營(yíng)養(yǎng)缺乏、腫瘤等的輔助治療。

1969年Mcord和Fridvich從牛血發(fā)現(xiàn)并提取出超氧化物歧化酶以來(lái)，SOD的生產(chǎn)取得了重在進(jìn)展。目前，生產(chǎn)SOD大體上有二種方法，第一方法是傳統(tǒng)方法，從動(dòng)物血中提取SOD，由于血制品SOD存在外源感染的危險(xiǎn)性和非人源制品SOD用于人體有抗原性，在醫(yī)療中很難發(fā)揮作用，而且成本高，原料來(lái)源有限，歐洲從1999年就禁止長(zhǎng)期用于人體上；第二種方法是植物中提取SOD，雖然可以消除病毒、外源性污染等弊端，但由于植物中SOD含量低，很難實(shí)現(xiàn)工業(yè)批量生產(chǎn)。上述提取SOD生產(chǎn)流程，都是采用傳統(tǒng)工藝中的抽提、離子交換、分子篩等分離、純化工序，提取過(guò)程復(fù)雜，收率低。目前，尚未發(fā)現(xiàn)把當(dāng)代生物科學(xué)技術(shù)應(yīng)用到SOD產(chǎn)業(yè)中，采用一步法制備基因重組人源銅、鋅超氧化歧化酶工藝，基因重組生產(chǎn)SOD是當(dāng)含世界最前沿技術(shù)，基因重組生產(chǎn)SOD具有無(wú)外源性污染、無(wú)免疫排斥、無(wú)蛋白種屬差異、無(wú)病毒殘存，且純度高、活性高，最適于人體，是SOD產(chǎn)業(yè)從技術(shù)到質(zhì)量上的一次革命。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有提取SOD技術(shù)中的不足，提供一種具有無(wú)外源性污染、無(wú)免疫排斥、無(wú)蛋白種屬差異、無(wú)病毒殘存，且純度高、活性高的一步法制備基因重組人源銅、鋅超氧化歧化酶工藝，更好地發(fā)揮SOD對(duì)急病其預(yù)防、治療的作用。

本發(fā)明提出的一步法制備基因重組人源銅、鋅超氧化歧化酶工藝，其主要技術(shù)在于：

一、溫控分泌型人源SOD菌種，應(yīng)用基因重組技術(shù)將PRPL啟動(dòng)子和STII信號(hào)肽及人SOD基因克隆至PBR322中，構(gòu)建了分泌型表達(dá)質(zhì)粒PBV/STII/SOD。此質(zhì)粒帶有溫控型啟動(dòng)子PRPL，帶有STII信號(hào)肽，使所表達(dá)的外源蛋白以可溶形式分泌到細(xì)胞周基質(zhì)中，給外源蛋白的進(jìn)一步純化帶來(lái)方便。將構(gòu)建的分泌型表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌W3110，獲得重組人源銅鋅超氧化物歧化酶菌種。

超氧化物歧化酶溫控分泌型菌種構(gòu)建，見(jiàn)附圖。

二、工程發(fā)酵培養(yǎng)

1、菌種篩選工藝

劃線培養(yǎng)→試管培養(yǎng)→挑單菌落→小試表達(dá)→擴(kuò)增培養(yǎng)→生產(chǎn)用菌

2、種子液的制備

a.取凍存菌種1支，用接種環(huán)取小量菌種在LB平皿上劃線，(LB培養(yǎng)液的制備：蛋白胨56g，酵母粉28g，NaCe56g，溶液5.6L)30℃培養(yǎng)20-24小時(shí)。

b.挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)基試管中，30℃，150-180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)10-15小時(shí)，待OD值達(dá)18-20，接種于發(fā)酵罐中。

3、發(fā)酵罐培養(yǎng)

a、采用改良的M9培養(yǎng)基，(M9培養(yǎng)基的的制備：80L發(fā)酵罐中蛋白胨800g，酵母粉500g，NaHPO₄320g，KH₂PO₄110g，NaCe100g，NH₄Ce70g，MgSo₄13.4g，CaLe0.5g，CuSo₄10g，ZnSo₄0.5g，葡萄糖600g。)。

b.發(fā)酵罐空消：條件121℃，30分鐘。

4、接種，將單獨(dú)滅菌的罐培養(yǎng)基分份注入罐內(nèi)，在滅菌條件下，保護(hù)子液接入發(fā)酵罐中。

5、培養(yǎng)

a.誘導(dǎo)培養(yǎng)前，每小時(shí)檢測(cè)一次OD值，并做鏡檢觀察菌形。

b.通過(guò)轉(zhuǎn)數(shù)和通氣量來(lái)控制溶氧值。

c.當(dāng)罐內(nèi)菌液OD600值為3.0時(shí)進(jìn)行升溫?zé)嵴T導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度42℃。

d.誘導(dǎo)后繼續(xù)培養(yǎng)二個(gè)半小時(shí)，出罐。

三、離心收集菌體