[發(fā)明專利]結(jié)核病特異抗原快速診斷試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710054375.6
• 申請日: 2007-05-10
• 公開（公告）號: CN101303355A
• 公開（公告）日: 2008-11-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 付光宇;顧軍;李桂林;屈長江;張躍鋒;馬建軍;翟維金;陸瑩;秦耘;楊增利;吳學(xué)煒
• 申請（專利權(quán)）人: 鄭州安圖綠科生物工程有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N33/549;G01N33/543
• 代理公司: 鄭州聯(lián)科專利事務(wù)所（普通合伙）
• 代理人: 田小伍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于免疫診斷領(lǐng)域，具體涉及一種結(jié)核病特異抗原快速診斷試劑盒。

背景技術(shù)

結(jié)核病是世界范圍內(nèi)的重要的經(jīng)濟(jì)和醫(yī)學(xué)問題。1995年世界上死于結(jié)核病的人數(shù)超過任何感染性疾病。病例死亡率估計(jì)在未治療的人群中為55％，在治療的病人中為15％。作為一種古老的傳染病，結(jié)核病的疫情在全球呈上升趨勢。據(jù)WTO估計(jì)，目前全世界約有20億人感染結(jié)核桿菌，每年有800萬新發(fā)病例和300萬人的死亡[1]。在我國，根據(jù)2000年第四次全國結(jié)核病調(diào)查估算，全國約有5.5億結(jié)核病例，將近全國人口的一半[2]。我國目前結(jié)核病的形式嚴(yán)峻。盡快建立先進(jìn)的診斷技術(shù)和治療措施，是一個緊迫的任務(wù)。不僅關(guān)系到千萬人身心健康，也是關(guān)系到國民生計(jì)和國家經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要問題。

隨著診斷技術(shù)的進(jìn)步以及對結(jié)核分枝桿菌研究的不斷深入，結(jié)核病診斷的實(shí)驗(yàn)技術(shù)層出不窮，涌現(xiàn)出許多新的檢驗(yàn)方法[3]。目前，細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)仍是診斷結(jié)核病常用方法。痰涂片鏡檢是確診的依據(jù)，也是發(fā)現(xiàn)結(jié)核病最經(jīng)典，最有效的手段。為了提供檢出率，還可使用熒光鏡檢法。血清學(xué)方法為結(jié)核病的快速，準(zhǔn)確診斷提供了另一種選擇。由于結(jié)核分枝桿菌的抗原性較弱，屬間和種間有共同的抗原決定族，體液免疫與結(jié)核病的相關(guān)性不太確切，因而尋找靈敏度和特異性均高的單體蛋白是目前這個領(lǐng)域研究的一個熱點(diǎn)。除此以外，PCR具有敏感性高，特異性強(qiáng)以及快速等優(yōu)點(diǎn)，但不能鑒別感染菌的死活，同時也由于極易被污染而產(chǎn)生假陽性結(jié)果，給診斷帶來不確定性。PCR-熒光探針雜交法，PCR-微孔板雜交法，PCR-分子燈塔法等均具有簡便，快速，抗污染，靈敏度高，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)屬于比較先進(jìn)的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，也是結(jié)核病輔助診斷的有效方法。基因芯片技術(shù)是新近發(fā)展起來的技術(shù)，主要用于結(jié)核桿菌耐藥基因突變檢驗(yàn)，具有快速和靈敏的優(yōu)點(diǎn)。連接酶鏈反應(yīng)雖然沒有PCR的靈敏度高，但具有比較高的識別能力，適用于結(jié)核病初篩，可用于早期診斷。結(jié)核分枝桿菌噬菌體法具有廉價，簡單，特異等特點(diǎn)，同時能鑒別菌的死活，有望成為結(jié)核菌耐藥性的快速檢測技術(shù)。然而，目前這些方法都有一定的特點(diǎn)和優(yōu)勢，但又不同程度存在一些缺陷。因此，發(fā)現(xiàn)和建立更完善和準(zhǔn)確快捷的結(jié)核病診斷方法或技術(shù)對于結(jié)核病的診斷和治療不僅是必須的，而且還相當(dāng)緊迫。

在所有上述診斷技術(shù)中，血清學(xué)技術(shù)主要是基于經(jīng)典的抗原抗體反應(yīng)以及酶聯(lián)的顯色反應(yīng)或酶促化學(xué)發(fā)光反應(yīng)或膠體金標(biāo)記技術(shù)，因其可靠，簡便以及快速而受到青睞。機(jī)體感染結(jié)核菌后，可以產(chǎn)生各種抗體，誘導(dǎo)產(chǎn)生這些抗體的抗原是結(jié)核分枝桿菌的各種組份，其中一類重要的成份是該菌分泌的各類蛋白(酶)。在結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)濾液里發(fā)現(xiàn)了100多種分泌蛋白質(zhì)，這些蛋白在結(jié)核病人的免疫反應(yīng)中起著重要作用，因此在結(jié)核病的診斷和預(yù)防及其治療上有著很好的運(yùn)用前景。尋找新的免疫原性強(qiáng)和種屬特異度高的結(jié)核抗原，發(fā)展快速、敏感、特異的診斷方法，是及時發(fā)現(xiàn)、治療并控制結(jié)核病的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在通過基因工程表達(dá)并純化desA蛋白，制作desA單抗，提供一種結(jié)核病血清學(xué)檢測的方法。其具體應(yīng)用方法包括酶聯(lián)免疫反應(yīng)法，酶促化學(xué)發(fā)光法及膠體金標(biāo)記法等。

酶聯(lián)免疫法(ELISA)：利用雙抗體夾心法將一株desA單抗固相于酶標(biāo)微反應(yīng)孔上，將另一株desA單抗或多抗標(biāo)記辣根過氧化物酶(HRP)，通過TMB顯色檢測血清中的結(jié)核病特異性抗原。將TMB顯色底物更換為Luminol化學(xué)發(fā)光底物，可以定量檢測結(jié)核病抗原的具體含量。其優(yōu)點(diǎn)是檢測信號強(qiáng)，線性范圍寬。此外將膠體金標(biāo)記DesA單抗或多抗，利用免疫紙層析技術(shù)開發(fā)出的膠體金快速診斷試紙條，具有靈敏度高，快速方便，不需用昂貴的檢測設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1、酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測結(jié)核病特異性抗原。

采用基因工程表達(dá)并純化desA蛋白并制作desA單抗包被酶聯(lián)板，用另一株單抗或多抗標(biāo)記辣根過氧化物酶，與其他試劑組成試劑盒，應(yīng)用雙抗體夾心法檢測人血清或血漿中的結(jié)核病特異性抗原，用于臨床結(jié)核病人感染的篩查。

【試劑盒組份】

(1)測結(jié)核病特異性抗原酶聯(lián)板???1塊(96孔)

(2)樣品稀釋液?????????????????1瓶(7ml)

(3)測結(jié)核病特異性抗原酶標(biāo)抗體?1瓶(13ml)

(4)陽性對照(已滅活)???????????1瓶(1ml)

(5)陰性對照(已滅活)???????????1瓶(1ml)

(6)20×洗滌液?????????????????1瓶(50ml)