[發(fā)明專利]一種表達抑制細胞生長多肽的腺病毒的構(gòu)建及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710052268.X
• 申請日: 2007-05-24
• 公開（公告）號: CN101100679A
• 公開（公告）日: 2008-01-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 夏獻民;程愛武;胡俊波;周劍峰
• 申請（專利權(quán)）人: 夏獻民
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N15/54;A61K48/00;A61P35/00
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一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種含有編碼由25個氨基酸構(gòu)成的能抑制細胞生長的多肽(甲硫氨酸-天門冬氨酸-精氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸-丙氨酸-天門冬氨酸-色氨酸-精氨酸-谷氨酸-纈氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸)核酸序列的腺病毒。同時，本發(fā)明還涉及這一腺病毒的制備和純化，在制備抗腫瘤藥物中的用途以及在腫瘤及其它增殖性疾病治療中的應(yīng)用，屬于醫(yī)學(xué)生物工程藥物領(lǐng)域。

二、背景技術(shù)

腫瘤是一種嚴重危害人類健康的疾病，目前其死亡率在國內(nèi)已成為僅次于心腦血管疾病的第二位致死病因。臨床中主要應(yīng)用化療、放療及手術(shù)治療，這些方法形成了比較成熟的治療體系，取得了較好的效果。然而，由于這些方法選擇性低，難以避免毒副作用強、正常細胞和腫瘤之間治療窗口小等缺點，因此亟待研發(fā)新的有效治療方法。

近來腫瘤細胞生物學(xué)的快速發(fā)展，為滿足這一社會需求提供了現(xiàn)實的可能性，其中，隨著細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Signaling?transduction?pathways)的闡明，發(fā)現(xiàn)了越來越多可用作治療腫瘤的藥靶。有一些已經(jīng)成功的應(yīng)用于臨床，取得了非常好的效果。比如在許多乳腺癌細胞中ErbB2(一種能促進蛋白磷酸化的上皮生長因子受體)過度表達，并且其蛋白激酶活性也增強，應(yīng)用一種特異性針對這一蛋白單克隆抗體能有效的抑制ErbB2蛋白激酶活性，阻斷這一蛋白介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。這一抗體目前已進入臨床使用。

細胞生長的信號由細胞內(nèi)外促進生長的因子經(jīng)過一系列蛋白參與傳遞到細胞核，引起細胞周期的許多調(diào)節(jié)蛋白結(jié)構(gòu)和功能變化而導(dǎo)致細胞分裂。在這些調(diào)節(jié)細胞生長周期的蛋白中，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)是一個具有脂磷酸化激酶和蛋白磷酸化激酶活性的酶蛋白，其激酶活性受到許多信號傳遞分子的影響。由于磷脂酰肌醇-3-激酶在細胞生長調(diào)節(jié)中的極重要的作用，這一蛋白是目前研究開發(fā)治療腫瘤新藥的重要靶標(biāo)之一。至今為止，已發(fā)現(xiàn)多個磷脂酰肌醇-3-激酶激酶活性的抑制劑，但由于磷脂酰肌醇-3-激酶的酶活性也是體內(nèi)一些重要生理功能所必需的(比如胰島素調(diào)節(jié)人體內(nèi)血糖和其它物質(zhì)和能量代謝過程)，而這些抑制劑在抑制磷脂酰肌醇-3-激酶激酶活性的同時，往往也阻斷了這些生理功能，具有很強的毒性，所以在治療疾病中的應(yīng)用受到較大限制。

2003年，我們發(fā)現(xiàn)了細胞生長周期的調(diào)節(jié)蛋白-視神經(jīng)母細胞瘤蛋白(Rb)和磷脂酰肌醇-3-激酶的一個調(diào)節(jié)亞基的相互作用。磷脂酰肌醇-3-激酶由調(diào)節(jié)亞基和催化亞基組成，催化亞基催化某些脂類及蛋白質(zhì)上的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化的活性是磷脂酰肌醇-3-激酶蛋白的核心效應(yīng)組成部分，然而，催化亞基的活性受調(diào)節(jié)亞基的調(diào)控，調(diào)控通過以下兩個機制實現(xiàn)：(1)催化亞基的活性本身受調(diào)節(jié)亞基影響；(2)調(diào)節(jié)亞基通過和其他蛋白的相互作用把催化亞基定位于目標(biāo)蛋白。我們研究發(fā)現(xiàn)，視神經(jīng)母細胞瘤蛋白和磷脂酰肌醇-3-激酶的相互作用是由磷脂酰肌醇-3-激酶中的55千道爾頓的調(diào)節(jié)亞基(p55PIK)中氨基端1-25號氨基酸(序列為：甲硫氨酸-天門冬氨酸-精氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸-丙氨酸-天門冬氨酸-色氨酸-精氨酸-谷氨酸-纈氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸)參與的，該多肽片段被稱為Rb結(jié)合功能區(qū)(以下稱為N25)，它把PI3K和Rb相互連接在一起，PI3K的蛋白激酶活性導(dǎo)致了Rb的磷酸化，從而引起了細胞分裂。我們進一步的實驗結(jié)果證明在細胞中表達p55PIK中N25的多肽，這一多肽能有效地結(jié)合于Rb，競爭性抑制細胞內(nèi)PI3K和Rb的結(jié)合，由于這個多肽不具有任何磷酸化蛋白激酶活性，所以多肽結(jié)合Rb將抑制Rb的磷酸化過程，保持Rb抑制細胞生長的功能，從而阻止腫瘤細胞分裂。

除Rb外，我們新的的實驗結(jié)果也證實N25多肽在細胞內(nèi)還能阻止p55PIK和其他細胞周期調(diào)節(jié)分子的結(jié)合，也能有效地抑制細胞的分裂過程。

三、發(fā)明內(nèi)容

雖然試驗結(jié)果證明在細胞中表達的N25多肽能有效抑制細胞生長，但由于N25多肽自身不能穿過細胞膜，導(dǎo)致直接應(yīng)用N25多肽作為藥物的療效并不理想，另外采用化學(xué)合成N25多肽的成本較高，所以N25多肽藥物的臨床應(yīng)用受到了一定的限制。