[發(fā)明專利]結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白Hsp16.3的表達方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710051915.5
• 申請日: 2007-04-19
• 公開（公告）號: CN101289650A
• 公開（公告）日: 2008-10-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 范雄林;石春薇;付瑞玲
• 申請（專利權(quán)）人: 華中科技大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 武漢開元專利代理有限責任公司
• 代理人: 樊戎

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及蛋白的表達和分離純化，具體涉及構(gòu)建大腸桿菌重組工程菌株、發(fā)酵、經(jīng)IPTG誘導Hsp16.3蛋白的表達，分離純化獲得Hsp16.3蛋白。

背景技術(shù)

結(jié)核病(TB)是嚴重影響全球人類健康的重要公共衛(wèi)生問題之一。最近十幾年來，TB的發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢，每年250萬人因TB而死亡。我國感染結(jié)核分枝桿菌(MTB)的人數(shù)達到5.5億，每年死于TB的人數(shù)約13萬。

慢性感染和細菌在感染者體內(nèi)的持續(xù)存在是TB的顯著特征。慢性患者體內(nèi)的MTB容易形成休眠，是TB治療需時長且難以徹底治愈的根本原因。而且休眠也是TB容易惡化和以后復發(fā)的根源。因而，研究針對休眠的治療藥物、疫苗或檢測診斷措施是當前全球和我國緊迫而且重要的問題。

熱休克蛋白Hsp16.3是結(jié)核分枝桿菌在正常有氧條件下其表達水平低，甚至難以檢測出；而休眠過程中過表達的一種蛋白質(zhì)，同時病原體在此過程中細胞壁的形成增厚，有利于病原體在機體巨噬細胞內(nèi)的寄生和長期潛伏。因此認為Hsp16.3蛋白是結(jié)核桿菌休眠的標志性蛋白之一。Hsp16.3蛋白由144個氨基酸組成，分子量16.3KD。Hsp16.3蛋白具有強的免疫原性，在慢性患者體內(nèi)可以刺激機體產(chǎn)生強的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答。機體產(chǎn)生針對Hsp16.3蛋白的抗體，可以利用Hsp16.3蛋白用于疾病的血清學診斷。Hsp16.3蛋白可與合適的佐劑如磷?；|(zhì)A(MPL)制成亞單位疫苗，產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答，用于防治細菌在體內(nèi)休眠或潛伏感染的治療型或預(yù)防性疫苗。同時Hsp16.3也是一個重要藥物靶位，構(gòu)成抗休眠新藥研制的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

由于獲得大量的Hsp16.3蛋白具有很大的困難。采用基因工程方法，構(gòu)建重組Hsp16.3蛋白工程菌株，是大規(guī)模生產(chǎn)Hsp16.3蛋白的最佳途徑。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種高效表達結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3蛋白的方法。具體是采用DNA重組技術(shù)構(gòu)建大腸桿菌重組工程菌株，經(jīng)發(fā)酵和SDS-PAGE鑒定，證明重組菌能夠高效表達Hsp16.3蛋白；利用結(jié)核病人血清作為一抗，該蛋白經(jīng)Western?blot檢測，表明它具有較強的特異性；利用不同種分枝桿菌小鼠血清，包括H37Rv，卡介苗和H37Ra感染小鼠血清，或M.smegmatis(恥垢分枝桿菌)、M.phlei(草分枝桿菌)、M.terrae(土地分枝桿菌)、M.triviale(次要分枝桿菌)和M.vaccae(母牛分支桿菌)免疫鼠血清，Hsp16.3蛋白均可特異性結(jié)合，具有廣譜的免疫反應(yīng)性。

本發(fā)明的具體操作步驟如下：

1.構(gòu)建重組表達質(zhì)粒

參照GenBank公布的結(jié)核桿菌H37Rv?Hsp16.3編碼基因HspX設(shè)計特異性的一對擴增引物。

HspXF：5’-AAGGATCCATGGCCACCACCCTTC

說明：下劃線代表是BamHI位點

HspXR：5’-AGAAGCTTTCAGTTGGTGGACCGG

說明：下劃線代表是HindIII位點

以結(jié)核桿菌H37Rv菌株為模板，用以上兩條引物進行PCR擴增。PCR擴增條件是：95℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃45s，30循環(huán)，72℃延伸10min。PCR擴增產(chǎn)物純化后，用BamHI和HindIII雙酶切，克隆構(gòu)建入原核表達載體pProEXHTb(Invitrogen公司產(chǎn)品)。篩選陽性克隆，并雙酶切鑒定。酶切鑒定正確的質(zhì)粒進行序列測定證實。

2.重組工程菌株的建立和表達

重組表達質(zhì)粒pProHspX轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株BL21，并發(fā)酵培養(yǎng)，IPTG誘導，離心收集菌體，經(jīng)SDS-PAGE電泳證明能高效表達分子量大小為19kDa的Hsp16.3蛋白，以包涵體形式存在。

3.規(guī)模發(fā)酵

將上述重組菌株用LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)過夜，按1∶100比例接種新鮮LB培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，IPTG誘導后4h-6h，10000rpm離心10min，收集菌體，經(jīng)檢測證實Hsp16.3蛋白的表達水平高達200mg/L.

4.分離純化