[發明專利]一種固定化乙酰膽堿酯酶片和配套基質片及兩者的制備方法和用途

無效

• 申請號: 200710051737.6
• 申請日: 2007-03-26
• 公開（公告）號: CN101054573A
• 公開（公告）日: 2007-10-17
• 發明（設計）人: 王承明;閻玉林;彭云峰;吳謀成;楊健;徐盈
• 申請（專利權）人: 華中農業大學;中國水產科學研究院淡水漁業研究中心;中國科學院水生生物研究所
• 主分類號: C12N11/00
• 分類號: C12N11/00;C12N9/18;G01N33/52
• 代理公司: 武漢華旭知識產權事務所
• 代理人: 劉榮

技術領域

本發明涉及一種固定化乙酰膽堿酯酶片和配套基質片，及兩者的制備方法和用途，屬于生物技術領域。

背景技術

現在市場上銷售的農藥殺蟲劑中，50％以上屬于有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑，其產量占70％以上。這類殺蟲劑因價格低、產生抗藥性的速度和程度均低于擬除蟲菊酯類殺蟲劑，頗受農民歡迎。對于農藥質量的檢測，雖已有必要的檢測方法和手段，但多局限于在特定的實驗室內進行，用氣譜、液譜等大型儀器檢測。這些設備操作復雜，價格昂貴，工作條件要求高，抽樣檢查時間長。目前農藥快速檢測常用的方法是酶抑制法，酶抑制法是一種簡便、靈敏、經濟、快速的檢測方法，利用這一原理生產的各種速測卡、速測儀，由于其高度的專一性、靈敏性和準確性，正在廣泛用于果蔬生產基地以及監督部門。檢測用的酶則是決定檢測靈敏度的關鍵因素，現有技術中通常用的是從家畜肝臟、馬血清、果蠅和植物等中提取的乙酰膽堿酯酶。以測定乙酰膽堿酯酶(AChE)活力被抑制的程度來判斷農藥殘留是否超標。它可將抽查的蔬菜樣本先進行粗篩，將有殘毒問題的蔬菜再用氣相色譜儀等分析儀器進一步定性和定量分析。如果蔬菜的提取液中不含有機磷或氨基甲酸酯類農藥或殘留量低，酶的活性就不被抑制，試驗中加入的基質底物就被酶水解或少部分水解，水解產物與加入的顯色劑反應產生顏色；反之，如果蔬菜的提取液中含有一定量的氨基甲酸酯類農藥，酶的活性就被抑制，試驗中加入的基質就不能被酶水解，從而不會發生顏色變化或顏色變化很小，用分光光度計法計算出抑制率，就可以判斷出蔬菜中含有機磷或氨基甲酸酯類農藥的殘留情況。然而這種方法存在一些不足。首先，所用乙酰膽堿酯酶(AchE)價格昂貴；其次，由于是在體外進行抑制，某些農藥對AChE的抑制并不明顯。

與游離酶相比，固定化酶具有穩定性強，重現性好，能重復使用等優點，關于把乙酰膽堿酯酶(AchE)做成酶片，然后再利用顯色反應進行氨基甲酸酯農藥檢驗方面的研究在本領域目前很活躍，但現在的研究程度尚僅限于制作，還不能利用其對農藥進行檢測。

發明內容

本發明的目的是提供一種固定化乙酰膽堿酯酶片和配套基質片，及兩者的制備方法和用途，用該固定化乙酰膽堿酯酶片和配套基質片能用于檢測氨基甲酸酯類農藥，特別是能簡便、快速地檢測到氨基甲酸酯類農藥是否殘留。

實現本發明目的的技術方案是一種固定化乙酰膽堿酯酶片，酶片的載體為定性濾紙，乙酰膽堿酯酶吸附于定性濾紙中。

且酶片中的乙酰膽堿酯酶的酶源為鯽魚腦。實施例中將對從鯽魚腦中提取乙酰膽堿酯酶的工藝予以說明。

本發明提供的該固定化乙酰膽堿酯酶片的制備方法是采用物理吸附法，以定性濾紙為固定載體制備，具體步驟如下：將從鯽魚腦中提取的乙酰膽堿酯酶冷凍干燥，用0.05～0.5mol/·L、pH?7.0-8.0的磷酸緩沖液稀釋至0.75-10U單位酶液，在酶液中同時加入占總重量0.5～3％的明膠混合，置于培養皿中，然后將所需規格、數量的定性濾紙片放入培養皿中浸泡，當所有濾紙片充分潤濕后，取出于2-25℃條件下，避光干燥，1-5℃密封保存，即得到固定化乙酰膽堿酯酶片。

其中所用乙酰膽堿酯酶的酶源為鯽魚腦，所用定性濾紙片為直徑為5～20mm?mm的圓形紙片。

本發明還提供了與該固定化乙酰膽堿酯酶片成套使用的基質片，基質片是按如下方法制備的：將重量百分比為0.1～1％的百里香酚藍酒精溶液與0.1～0.5mol·L^-1的氯化乙酰膽堿溶液按體積比1∶1～1∶5的比例混合，用0.05～0.2mol·L^-1的氫氧化鈉溶液滴定，使其顏色由紅變藍，瞬間馬上停止滴定，加入到培養皿中，將待用的濾紙片放入到該培養皿中，當所有濾紙片充分潤濕后，取出在2～25℃條件下晾干，最后于1～5℃下，密封、避光保存，即得到基質片。

將本發明提供的固定化乙酰膽堿酯酶片和基質片成套使用，能用于檢測氨基甲酸酯類農藥，特別是用于各種蔬菜水果的快速農藥殘留檢驗。

目前在乙酰膽堿酶研究中酶源通常為家畜肝臟、馬血清、果蠅和植物等，而本發明制備的乙酰膽堿酶酶片的酶源是鯽魚腦，不僅所獲得的酶重現性好、熱穩定性好，而且來源廣泛、成本低廉。又由于本發明中的酶片采用物理吸附法制備，不涉及化學反應，酶活力損失較小，因此酶活回收率較高。且選用的載體為定性濾紙，濾紙含有豐富的纖維素，特別適合作為制備固定化乙酰膽堿酯酶片的固定化載體。