[發(fā)明專利]快速測定銅藍(lán)蛋白的免疫共振散射光譜法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710050604.7
• 申請(qǐng)日: 2007-11-19
• 公開（公告）號(hào): CN101158690A
• 公開（公告）日: 2008-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韋麗麗;蔣治良
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西師范大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/541;G01N21/63
• 代理公司: 桂林市華杰專利事務(wù)所有限責(zé)任公司
• 代理人: 孫伊濱

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及蛋白的測定方法，特別是一種能快速測定銅藍(lán)蛋白的免疫共振散射光譜法。

背景技術(shù)：

銅藍(lán)蛋白屬于α₂-球蛋白(CER)，是一種含銅的α-糖蛋白，是人類和脊椎動(dòng)物體內(nèi)唯一的藍(lán)色蛋白質(zhì)。目前CER檢測方法很多，如根據(jù)其氧化酶特性，應(yīng)用對(duì)苯二胺(PPD)法；根據(jù)其免疫學(xué)特性，測定方法有酶聯(lián)免疫吸附法、放射免疫分析法、免疫沉淀比色分析法、火箭免疫電泳分析法、免疫電擴(kuò)散分析法，此外，還有脈沖激光聲分析法、應(yīng)用速率散射濁度法等，以上這些方法有的是靈敏度不高，有的是步驟繁瑣，有的由于基質(zhì)、反應(yīng)條件等不一致，而結(jié)果缺乏可比性，有的抗血清用量大，且純度要求高，不易操作。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提供一種能簡便快速測定銅藍(lán)蛋白的免疫共振散射光譜法。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的技術(shù)方案是：利用銅藍(lán)蛋白和羊抗人銅藍(lán)蛋白在一定溫度水浴條件下，產(chǎn)生特異性免疫結(jié)合反應(yīng)生成免疫復(fù)合的微粒，此復(fù)合物微粒存在共振散射，銅藍(lán)蛋白在一定濃度范圍內(nèi)隨著其濃度的增加，其共振散射強(qiáng)度線性增強(qiáng)，采用熒光分光光度計(jì)對(duì)生成的免疫復(fù)合物進(jìn)行同步掃描得到共振散射光譜，依照共振散射強(qiáng)度與CER濃度的線性關(guān)系，快速測定出血清中銅藍(lán)蛋白。

應(yīng)用免疫共振散射光譜法快速測定銅藍(lán)蛋白，包括如下步驟：

(1)制備已知CER濃度的測試體系：依次移取0.30mL?pH值為6.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，0.20mL稀釋25倍的羊抗人CER溶液，一定量10.8μg/mL的CER溶液，0.50mL質(zhì)量濃度為15％的PEG-6000溶液于5mL帶刻度的試管中，用二次蒸餾水定容至2.0mL，混勻，在37℃水浴鍋中溫育15min；

(2)用步驟(1)的方法不加CER制備空白對(duì)照體系；

(3)分別取上述體系于石英池中，在熒光分光光度計(jì)上同步掃描激發(fā)波長λex和發(fā)射波長λem(λex＝λem)，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5.0nm，測定電壓為450V，得到體系的共振散射光譜，測定490nm處的散射強(qiáng)度I_RS，試劑空白為I₀，計(jì)算ΔI_RS＝I_RS-I₀；

(4)以ΔI_RS對(duì)CER的濃度關(guān)系作工作曲線；

(5)依照步驟(1)的方法制備檢測體系，其中加入的CER為含有CER但未知濃度的被測物，求出被測物的ΔI_RS；

(6)依據(jù)(4)的工作曲線，計(jì)算出被測物的CER的濃度。

本方法檢測銅藍(lán)蛋白的濃度線性范圍為27～927μg/ml。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：

(1)與已有的方法相比，本測定方法的儀器簡單，操作簡便，抗干擾強(qiáng)，靈敏度高，選擇性好，反應(yīng)條件容易達(dá)到。

(2)試劑僅為磷酸鹽緩沖溶液、羊抗人CER溶液、CER溶液、PEG-6000溶液，所用羊抗人CER溶液和CER溶液濃度較低，試劑用量少且均無毒。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明實(shí)施例的銅藍(lán)蛋白免疫共振散射光譜圖，

圖中曲線a至e表示a；pH6.4?PBS-羊抗人CER-37.5mg/mL?PEG6000；b：a-0.027μg/ml?CER；c：a-0.324μg/ml?CER；d：a-0.648μg/ml?CER；e：a-0.972μg/ml?CER。

具體實(shí)施方式：

下面的實(shí)施例闡述了本發(fā)明建立CER的免疫共振散射光譜分析法的原理是：

聚乙二醇(PEG)是乙二醇的聚合物，為一種無電荷線形分子的多糖，PEG可引起免疫復(fù)合物沉淀，沉淀具有可逆性，被沉淀的蛋白質(zhì)的活性不受影響，可用于免疫復(fù)合物的測定。CER與羊抗人CER之間存在結(jié)構(gòu)和空間上的互補(bǔ)性及親和性，會(huì)發(fā)生免疫反應(yīng)，生成不溶性免疫復(fù)合物，其作用力包括電荷引力、范德華力、氫鍵結(jié)合力、疏水等作用力，二者之間的反應(yīng)具有較高的特異性，生成的免疫復(fù)合物存在共振散射。在PH6.4的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄(PBS)緩沖液中，CER在一定濃度范圍內(nèi)隨著其濃度的增加，在490nm處的共振散射強(qiáng)度線性增強(qiáng)，據(jù)此建立CER的免疫共振散射光譜分析法。

實(shí)施例：

一種能快速測定銅藍(lán)蛋白的免疫共振散射光譜法包括如下步驟：