[發明專利]特異檢測強毒型和中毒型雞新城疫病毒的熒光定量PCR引物及方法

無效

• 申請號: 200710050161.1
• 申請日: 2007-09-30
• 公開（公告）號: CN101153343A
• 公開（公告）日: 2008-04-02
• 發明（設計）人: 岳華;湯承;劉小銀;楊發龍;張煥容
• 申請（專利權）人: 西南民族大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬病毒鑒別領域，尤其是涉及一種特異檢測強毒型和中毒型雞新城疫病毒的熒光定量PCR引物。

背景技術

新城疫病毒屬于副粘病毒科，引起雞的急性傳染病，該病對養雞業危害巨大。根據新城疫病毒的毒力差異可將其分為強毒型、中毒型、弱毒型3種類型，其中強毒型、中毒型新城疫病毒可引起雞新城疫病癥，因此，建立快速檢測強、中毒力型新城疫病毒的方法就顯得十分重要。聚合酶鏈式反應(PCR)技術是快速檢測病毒的最有效的方法之一，但目前采用PCR技術檢測雞新城疫病毒時，所設計合成的引物為通用性的，對各種毒力的新城疫病毒都呈現陽性結果，不能區分強、中、弱毒型。此外，傳統PCR技術在熱循環反應結束后還需要進行電泳來進行結果判定，相對比較繁瑣，且采用肉眼觀察的方法其敏感度相對不是很高。

發明內容

鑒于區別強、中毒力型新城疫病毒在疫病防治方面的特定實際意義，本發明的目的是根據不同毒力新城疫病毒F基因核苷酸序列組成的不同，設計并合成了一對能專門檢測強毒型及中毒型雞新城疫病毒的引物，旨在用于特異檢測強毒型及中毒型雞新城疫病毒的熒光定量PCR技術中，并使之具有較好的使用便利性和良好的敏感性。

檢測強毒型和中毒型雞新城疫病毒的特異引物的核苷酸鏈序列如下，分別為上游引物和下游引物：

SEQ?ID?NO：1?5′-GTGAATTCTTGATGGCAGGCCTCTTGC-3′

SEQ?ID?NO：2?5′-GCTTATTGCTACACTGCCG-3′

采用所示序列引物進行熒光定量PCR，只有強毒型和中毒型病毒株呈現陽性，而弱毒型病毒株為陰性。

PCR反應模板制備：從待測樣本提取RNA并反轉錄合成cDNA作為模板。PCR反應：采用SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示序列的引物；PCR反應體系為25μl時，在PCR管中依次加入SYBR^Premix?Ex?Taq^TM?12.5μl，SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示序列引物(濃度為10μM)各0.5μl，去離子水10.5μl，最后加入模板到25μl，混合后在熒光定量PCR儀上進行熱循環，其條件為：95℃變性3min；然后進行共40個94℃30s，58℃30s，72℃40s的循環，反應結束后進行溶解曲線分析；在無模板對照和空白對照沒有出現擴增曲線的條件下，凡出現擴增曲線且熔解溫度為86±1.0℃的均為陽性結果，不出現擴增曲線的為陰性結果。

用24株已知病毒類型的樣本進行檢測，采用所述引物進行SYBRGreen?I模式的熒光定量PCR，結果顯示，本發明所設計的引物只對雞新城疫病毒強毒型及中毒型病毒株有陽性擴增，而對該病毒弱毒株及其他非新城疫病毒來源的核酸沒有擴增曲線，呈現陰性，最后結果如圖1所示。

綜上所述，本發明根據不同毒力新城疫病毒F基因核苷酸序列組成的不同，設計并合成了一對能專門檢測強毒型及中毒型雞新城疫病毒的引物，可以在雞新城疫病毒的熒光定量PCR技術中提供對強毒型及中毒型病毒株的特異性檢測。實施例2敏感性實驗結果證明了引物和方法的良好敏感性。實施例3對兩只疑似NDV強毒株感染的雞只進行檢測并經核苷酸測序驗證實驗，證實了本發明引物和方法明顯的特異性。這樣可以對引起雞新城疫病癥的強毒型和中毒型新城疫病毒進行有效辨識，有利于快速防治措施的施行。

附圖說明

圖1為采用本發明的引物及方法對已知病毒類型的樣本進行SYBR?Green?I模式的熒光定量的PCR擴增曲線圖，其中，擴增曲線高于基線者為陽性；而低于基線者為陰性。

圖2為圖1之判斷結果列表。

圖3為本發明與常規血凝試驗定量檢測敏感度比較結果列表。

圖4為本發明實施例3熒光定量PCR的擴增曲線圖。

具體實施方式

實施例1：引物的特異性試驗