[發明專利]體外培養擴增的人肝臟祖先細胞及其制備方法

無效

• 申請號: 200710048724.3
• 申請日: 2007-03-26
• 公開（公告）號: CN101275121A
• 公開（公告）日: 2008-10-01
• 發明（設計）人: 蘆銀雪
• 申請（專利權）人: 蘆銀雪
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.?一種體外培養擴增傳代的人肝祖先細胞的制備方法，該方法包括：a、分離人肝祖先細胞；b、在含有人纖維蛋白膠或其類似物的胞外基質上，用無血清的培養基共培養飼養細胞和步驟a分離到的人肝祖先細胞，擴增得到人肝祖先細胞集落。

2.?根據權利要求1所述的方法，其還包括：步驟c、利用單細胞制備技術，將步驟b得到的人肝祖先細胞集落制備成單細胞懸液，進一步分離純化人肝祖先細胞。

3.?根據權利要求2所述的方法，步驟c所述的單細胞制備技術包括：

(a)將步驟b得到的人肝祖先細胞集落用膠原酶collagenase或高度純化的膠原酶liberase?blendzyme?3，或者其中之一與透明質酸酶或其他的中性蛋白酶的混合，酶解不超過4分鐘，收集培養物；

(b)將步驟(a)的培養物，用胰蛋白酶或Accutase消化，在不超過室溫條件下，消化時間不超過5分鐘，收集細胞培養物；

(c)將步驟(b)的細胞培養物懸浮于含分散酶的緩沖液中，再加入脫氧核糖核酸酶I，至白色絮狀物消失和細胞釋放，過濾、沉淀、收集沉淀細胞、加入緩沖液，得到單細胞懸液。

4.?根據權利要求1所述的方法，所述的人肝祖先細胞，包括人肝祖先細胞、肝母細胞、卵圓細胞，來源于人肝組織或人胰臟、骨髓，或人臍帶血、人脂肪組織以及分化的人胚胎干細胞。

5.?根據權利要求1所述的方法，所述的人纖維蛋白膠或其類似物是通過凝血酶作用于人纖維蛋白原或經聚乙二醇化修飾的人纖維蛋白原而制備的降解物。

6.?根據權利要求1所述的方法，所述培養基是無血清的合成培養基，其含有碳水化合物代謝調解劑、轉鐵蛋白組合物、高濃度的核苷組合物、肝素鈉、抗氧化物、人表皮細胞生長因子EGF、人堿性成纖維細胞生長因子bFGF、人血管內皮生長因子VEGF。

7.?根據權利要求1所述的方法，步驟b中所述的飼養細胞為人內皮細胞。

8.?根據權利要求1所述的方法，人內皮細胞是人臍帶靜脈血管內皮細胞或/和人肝竇內皮細胞，或/和其他的內皮細胞。

9.?一種由權利要求1所述的方法制備的體外擴增傳代的人肝祖先細胞。

10.?根據權利要求9所述的人肝祖先細胞，該人肝祖先細胞依共培養方法可傳代培養至少10代。