[發明專利]攜帶人β珠蛋白基因的βIVS-II-654轉基因小鼠模型的制備方法

有效

• 申請號: 200710047375.3
• 申請日: 2007-10-24
• 公開（公告）號: CN101418292A
• 公開（公告）日: 2009-04-29
• 發明（設計）人: 曾溢滔;李偉;曾凡一;黃淑幀
• 申請（專利權）人: 上海市兒童醫院
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/12;C12N15/86;A01K67/027
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司
• 代理人: 繆利明

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種攜帶人β珠蛋白基因的β^IVS-II-654轉基因小鼠 模型的制備方法。

背景技術

β地中海貧血是最常見的單基因遺傳病之一，全世界大約有8000萬攜帶者。β地貧主 要是β珠蛋白基因的點突變或缺失致使β珠蛋白鏈合成減少或完全缺乏所致的慢性貧血性 疾病，廣泛流行于地中海地區、中東、東南亞和非洲，我國南部省份也是高發區。嚴重的 β地中海貧血表現為紅細胞生成障礙和嚴重的貧血，需要終生輸血維持生命。但是由于鐵 離子的沉積，最終導致患者器官功能的衰竭而死亡。

β^IVS-II-654地中海貧血是中國人特有的一種突變類型的β地中海貧血，約占中國人β地 中海貧血的18～36％。該病由發生在第二內含子(IVS-II)的第654位(nt654)上C→T 突變引起，出現的單堿基取代產生了一個新的GT二核苷酸，聯同旁側序列構成一個新的 5’端異常的剪接位點，同時還激活了IVS-II第579位(nt579)處3’隱匿的剪接位點，從 而將IVS-2?nt580-nt652之間一段73bp內含子序列作為額外的片段插入外顯子2和外顯子 3之間，產生了異常的β-珠蛋白mRNA。在異常剪接的mRNA中存在一個提前的終止密 碼子，使得翻譯提前中止而產生極不穩定的異常β珠蛋白，這樣正常β珠蛋白鏈合成減少， 引起α鏈的相對升高。過剩的α鏈沉積在細胞膜上，使得紅細胞破壞，引起紅細胞生成障 礙和溶血性貧血。

當前，治療β地中海貧血最為有效的手段是進行造血干細胞移植，但是異體造血干細 胞的移植很難找到同型的供體，因此，通過基因修飾的自體造血干細胞移植成為二十年來 治療的新策略。

但是，通過基因修飾的方法仍然存在著障礙。要想獲得外源基因的高效表達，需要轉 入較長的β珠蛋白基因序列和調控元件。既往使用的逆轉錄病毒載體(oncoretroviral)雖 然可以取得有效的染色體整合，但是病毒的滴度往往較低、表達不夠理想并且容易發生基 因的重排。

來源于人類免疫缺陷病毒1(HIV-1)的慢病毒載體是逆轉錄病毒的一種，具有可以 感染非分裂期細胞、容納外源性目的基因片段大、免疫反應小等特點而成為一種新型的基 因治療載體系統，越來越受到人們的重視。2000年，May等人首次使用慢病毒載體(TNS9) 進行骨髓干細胞移植治療有效地改善了β地中海貧血的癥狀。此后，其它研究小組也相繼 證實了慢病毒載體介導治療β地貧和其它血紅蛋白疾病的效果。這為慢病毒載體應用于臨 床試驗展示了前景，但是，慢病毒載體所介導的基因治療的穩定性和安全性仍需要進一步 觀察。

發明內容

本發明的目的在于提供一種攜帶人β珠蛋白基因的β^IVS-II-654轉基因小鼠模型的制備方 法，包括步驟：

A、人β珠蛋白基因片段的克隆；

B、人β珠蛋白基因啟動子的克隆；

C、將人β珠蛋白基因、人β珠蛋白基因啟動子克隆到載體質粒，構建攜帶人β珠蛋 白基因的慢病毒載體LBG；

D、將慢病毒載體LBG與包裝質粒共轉染細胞，培養后獲得病毒顆粒；

E、將病毒顆粒進行β^IVS-II-654小鼠受精卵的卵周間隙顯微注射，得到攜帶人β珠蛋白 基因的β^IVS-II-654轉基因小鼠。

本發明的另一目的在于提供一種慢病毒載體LBG，所述慢病毒載體LBG攜帶有人β 珠蛋白啟動子，以及人β珠蛋白基因片段。

本發明的攜帶了人β珠蛋白基因的β⁶⁵⁴轉基因小鼠模型的基因組中穩定整合了慢病毒 載體介導的人β珠蛋白基因，并且能持續穩定的表達，而且可以遺傳給后代并能維持原表 達水平。發明人通過該轉基因小鼠模型，觀察到慢病毒載體介導的基因治療能夠有效、穩 定地改善β地貧的癥狀，在轉基因小鼠長期觀察中沒有發現其他異常變化，為在體內評價 基因治療的效果和安全性等問題提供了有效的手段。

附圖說明

圖1是人β珠蛋白慢病毒表達載體構建示意圖。

圖2是轉基因小鼠基因型鑒定PCR結果，依次為1、野生型小鼠；2、β⁶⁵⁴小鼠；3、 攜帶了人β珠蛋白基因的轉基因小鼠；4-6、攜帶了人β珠蛋白基因的β⁶⁵⁴轉基因小鼠 F0、F1和F2代。