[發明專利]用于骨髓間充質干細胞體外培養和擴增的無血清培養基

有效

• 申請號: 200710047035.0
• 申請日: 2007-10-15
• 公開（公告）號: CN101412985A
• 公開（公告）日: 2009-04-22
• 發明（設計）人: 周燕;吳偉;譚文松
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06;C12N5/08
• 代理公司: 上海翼勝專利商標事務所
• 代理人: 刁文魁;翟 羽

【技術領域】

本發明涉及生物技術領域的一種細胞培養基，尤其是一種用于骨髓間充 質干細胞體外培養和擴增的無血清培養基。

【背景技術】

骨髓間充質干細胞(MSCs)是骨髓基質的主要成份，為骨髓的造血功能 提供結構和功能上的支持。目前的研究表明，骨髓間充質干細胞能夠促進造 血系統的重建，具有有效的免疫調節功能，能夠在體外抑制T-淋巴細胞增殖， 延緩移植組織后出現的免疫排斥反應，還可以用于預防和治療自體干細胞移 植(ASCT)產生的移植物抗宿主疾病(GVHD)，避免在器官移植中產生免疫排 斥反應，以及治療自身免疫性疾病，如風濕性關節炎等。骨髓間充質干細胞 具有多向分化的潛能，能夠分化成多種細胞譜系，如成骨細胞、軟骨細胞、 肌細胞、脂肪細胞、肝細胞、腎細胞、心肌細胞和神經細胞等等，因而可以 通過組織工程技術進行組織修復和再生。由于骨髓間充質干細胞能夠分化成 多種細胞類型，并且免疫原性弱，因而可以作為組織工程理想的種子細胞來 源。另外，骨髓間充質干細胞易于外源基因的轉染和表達，可以廣泛地應用 于細胞治療和基因治療，具有十分廣闊的應用前景。但是，骨髓間充質干細 胞在骨髓中含量極少，大約10⁴～10⁵個骨髓單核細胞中僅含有一個骨髓間充質 干細胞，因此，僅僅通過自體或異體分離骨髓間充質干細胞顯然無法滿足臨 床需求，需要積極進行在體外培養和擴增骨髓間充質干細胞，以滿足人們在 應用上需求。

進行體外培養和擴增骨髓間充質干細胞(MSCs)通常需要在培養基中添 加一定量(10％～20％)的胎牛血清，這曾被認為是培養骨髓間充質干細胞的最 佳條件，且能較好地保持其生物學特性。

但是，使用動物血清具有兩面性：一方面，動物血清能很好地支持細胞 的生長：一是，血清中含有的大量的蛋白能夠對細胞起到保護作用；二是， 含有的微量元素和大量的營養成分能充實培養基以支持細胞的生長；三是， 含有的多種細胞因子能促進細胞增殖；四是，還能為貼壁依賴細胞提供貼壁 因子。

但在另一方面，對于動物血清生產的細胞產品，其生物安全性受到人們 的普遍質疑：一是，由于各批次血清之間的成分差異較大，從而對細胞產品 的穩定性產生影響；二是，成分不明確，大量的未知蛋白給研究工作帶來極 大的干擾；三是，更為嚴重的是，動物血清中可能含有由蛋白質構成的感染 物和未知的動物傳染病，在生產臨床級別的人用細胞產品時，理論上會導致 這些傳染物的傳播；四是，血清中的蛋白或肽可能在培養過程中被骨髓間充 質干細胞整合，這樣，當移植骨髓間充質干細胞時將導致宿主產生免疫反應。

為了克服動物血清在體外培養和擴增骨髓間充質干細胞(MSCs)時可能 存在的缺陷，從20世紀九十年代起人們就開始了無血清培養骨髓間充質干細 胞的研究。1995年，Donald等人開發了一種化學成分明確的無血清培養基 RDM-F，用于體外擴增大鼠骨髓間充質干細胞。該培養基以60％DMEM-LG加 40％MCDB-201為基礎培養基，添加5μg/mL的胰島素、0.1％(w/v)LA-BSA、 10ng/mL?PDGF-β?β和1ng/mL?bFGF，大鼠骨髓間充質干細胞在有血清培養基 中貼壁完全后，更換成無血清培養基RDM-F進行培養[Lennon，D.P.，et?al.， Exp?Cell?Res，219，p.211-222(1995)]。

Gronthos和Simmons等人以α-MEM為基礎培養基，添加了10μg/mL牛 胰島素、2％(w/v)BSA、4μg/mL人低密度脂蛋白、200μg/mL飽和人轉鐵蛋 白、2mmol/L?L-谷氨酰胺、10nM地塞米松磷酸鈉、100μM抗壞血酸(L-ascorbic acid?2-phosphate，ASAP)，50μM?β-巰基乙醇[Gronthos，S.，Simmons，P.J. Blood，85，p.929-940(1995)]。

臺灣長庚大學的劉繼賢等人開發了用于體外擴增臍血間充質干細胞的無 血清培養基，該培養基以IMDM為基礎培養基，添加了人血清白蛋白、氫化可 的松、SITE(SITE為商品名，是四種物質的簡稱：Selenite硒酸鹽、Insulin 胰島素、Transferrin轉鐵蛋白、Ethanolamine乙醇胺)和bFGF(堿性成纖 維細胞生長因子)[Chi-Hsien?Liu，et?al.，Biochem?Eng?J，33，p.1-9 (2007)]。