[發明專利]三分三托品酮還原酶Ⅱ基因及其編碼的蛋白質和應用

無效

• 申請號: 200710046998.9
• 申請日: 2007-10-12
• 公開（公告）號: CN101168739A
• 公開（公告）日: 2008-04-30
• 發明（設計）人: 開國銀;李禮;王敬;王偉;陸楊;周根余
• 申請（專利權）人: 上海師范大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12N15/82;A01H1/06
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司
• 代理人: 吳澤群

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體說，是涉及在三分三中表達的托品酮還原酶II基因及其編碼的蛋白質和應用。

背景技術

莨菪烷生物堿如莨菪堿(hyoscyamine)和東莨菪堿(scopolamine)等，主要是從茄科植物如顛茄、曼陀羅、莨菪及三分三(Anisodus?scutangulus)等中提取到的，在醫用方面是作用于副交感神經系統的抗膽堿藥，具有麻醉、解痙、止痛的功能。此外，還具有改善微循環的作用，臨床上可用于治療微循環障礙性疾病。由于我國學者的努力，莨菪烷生物堿的臨床應用遍及內科、外科、婦產科、神經科、皮膚科、耳鼻喉科等，能治療100多種疾病，市場需求十分巨大。

藥用植物三分三，為茄科多年生草本植物，主要分布于我國云南西北部，在云南民間它作為解痙鎮痛的中藥使用已有悠久歷史。三分三根部富含莨菪烷生物堿，據報道，野生三分三干燥品總生物堿含量高達1.2％，所含生物堿含量比世界上一些常用的茄科植物如顛茄、莨菪曼陀羅等均高的多。根據記載，七年生三分三總生物堿含量可高達5％。實驗表明，三分三所含生物堿絕大部分是莨菪烷類生物堿。隨著市場對莨菪烷生物堿的需求不斷擴大，尋找可以大量生產莨菪烷生物堿的替代方法已成為當前研究的熱點。近年來基因工程技術的飛速發展和廣泛應用，為利用現代生物技術提高托品烷生物堿含量開辟了一條嶄新的途徑。利用現代生物技術將莨菪堿生物合成途徑中的關鍵酶基因導入資源植物中，獲得轉基因植株，并進行大規模的培養，是實現從根本上提高莨菪烷生物堿含量的最佳途徑之一。

托品酮還原酶II(Tropinone?reductase?II，TRII)是整個莨菪堿生物合成途徑中的一個重要的分支催化酶，它和托品酮還原酶I(Tropinone?reductase?I)分別催化托品烷生物堿合成途徑中的一個重要分支點的兩個分支。其中托品酮還原酶I(TRI)專一的將托品酮的3-酮基還原成3α-羥基從而生成莨菪醇(3α-hydroxytropane)，而TRII則將托品酮的3-酮基還原成3β-羥基從而生成假莨菪醇(3β-hydroxytropane)。莨菪醇沿TRI支路最終生成莨菪堿和東莨菪堿，而假莨菪醇沿另一條支路最終生成Calystegines。這兩個酶的活力比值將決定代謝流在這一分支點的流向，因為目前在植物體內莨菪醇和假莨菪醇的互變還沒有被發現。利用反義基因技術來抑制資源植物如三分三等中托品酮還原酶II(Anisodus?acutangulus?Tropinone?reductase?II，AaTRII)的活性，從而減少旁路途徑終產物Calystegines的合成，推動更多的代謝流流向目標途徑繼而生成更多的莨菪堿和東莨菪堿，因此，克隆托品酮還原酶II的編碼基因有著十分重要的醫學價值。

在對現有文獻的分析中，“Plant?Physiology(植物生理)，1993，103，1465-1466”報道了從莨菪中克隆了托品酮還原酶II基因，但至今尚未有從我國云南特有的藥用植物三分三中分離克隆出托品酮還原酶II的文獻報道。由于這個基因編碼的酶對于莨菪烷生物堿的合成具有重要影響，因此，這一步是利用基因工程技術來調控莨菪烷生物堿生物合成的重要切入點。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種三分三托品酮還原酶II基因及其編碼的蛋白質與用途，以填補從我國云南特有的藥用植物三分三中分離克隆出托品酮還原酶II基因的空白。

本發明所提供的三分三托品酮還原酶II基因，是具有SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。

本發明所提供的三分三托品酮還原酶II基因編碼的蛋白質，是具有SEQ?IDNo.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸的同源序列。

含有本發明的三分三托品酮還原酶II基因全序列或部分片段的質粒和植物表達載體均屬于本發明的保護范圍。

一種宿主細胞，該細胞含有本發明的三分三托品酮還原酶II基因或質粒或植物表達載體的基因序列。

所述宿主細胞為大腸桿菌細胞、農桿菌細胞、酵母細胞、煙草細胞或其它植物細胞。

所述宿主細胞優選大腸桿菌細胞或農桿菌細胞或三分三發根細胞。

本發明的三分三托品酮還原酶II基因的應用，包括用所述的植物表達載體轉化三分三細胞或者用所述的農桿菌與三分三細胞共培養或者用所述的三分三發根細胞培育雄性不育植株或者用所述的托品酮還原酶II基因序列提供一種轉基因三分三。