[發(fā)明專利]建立神經(jīng)元煙堿型乙酰膽堿亞型受體細(xì)胞模型的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710046149.3
• 申請(qǐng)日: 2007-09-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101157918A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 殷明;聶惠貞;沈穎華;王澤劍;李佐青
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/09
• 分類號(hào): C12N15/09;C12N15/85
• 代理公司: 上海交達(dá)專利事務(wù)所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

1.一種建立神經(jīng)元煙堿型乙酰膽堿受體細(xì)胞模型的方法，其特征在于，包括如下具體步驟：

①表達(dá)載體pcDNA3.1(-)-APP695的構(gòu)建，將APP695基因克隆進(jìn)pcDNA3.1(-)質(zhì)粒；

②將pcDNA3.1(-)-APP695用脂質(zhì)體方法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染進(jìn)SH-EP1-α4β2細(xì)胞并用篩選抗生素進(jìn)行加壓篩選；

③穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆APP695?mRNA表達(dá)的鑒定，用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)APP695?mRNA表達(dá)；

④穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆APP695和Aβ蛋白表達(dá)的鑒定，用Western-blotting檢測(cè)細(xì)胞克隆APP695和Aβ的表達(dá)；

⑤穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆上煙堿α4β2受體功能鑒定，用膜片鉗鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆上煙堿α4β2受體的功能。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立神經(jīng)元煙堿型乙酰膽堿受體細(xì)胞模型的方法，其特征是，所述的APP695基因和pcDNA3.1(-)進(jìn)行Xbal?1和Hindlll雙酶切，凝膠回收后用T4?DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化至DH5α細(xì)菌，氨芐青霉素抗性篩選重組子pcDNA3.1(-)-APP695，擴(kuò)增提取質(zhì)粒，測(cè)序鑒定。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立神經(jīng)元煙堿型乙酰膽堿受體細(xì)胞模型的方法，其特征是，所述的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，采用脂質(zhì)體法LipofectamineTM?PLUS試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的建立神經(jīng)元煙堿型乙酰膽堿受體細(xì)胞模型的方法，其特征是，所述的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染3d后新霉素500g/L加壓篩選，14d后細(xì)胞單克隆形成，有限稀釋法將細(xì)胞進(jìn)行單克隆化，2周后單克隆長(zhǎng)滿96孔板，胰酶消化，轉(zhuǎn)入24孔板，長(zhǎng)滿后轉(zhuǎn)入12孔板培養(yǎng)，待長(zhǎng)滿后收集細(xì)胞進(jìn)行蛋白表達(dá)鑒定。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或者3或者4所述的建立神經(jīng)元煙堿型乙酰膽堿受體細(xì)胞模型的方法，其特征是，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染34d后收集單克隆細(xì)胞，用Trizol法按說(shuō)明書步驟提取細(xì)胞總RNA。以總RAN為模板，APP695引物1和引物2進(jìn)行PCR。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的建立神經(jīng)元煙堿型乙酰膽堿受體細(xì)胞模型的方法，其特征是，PCR程序具體為：94℃變性3min進(jìn)入循環(huán)過(guò)程，94℃變性1.5min，55℃退火1.5min，72℃延伸3min，循環(huán)31次后72℃復(fù)性10min。凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物；然后用α4和β2基因引物進(jìn)行PCR，α4引物為5’-CCATCGCTCAGCTCATTGACG-3’和5’-CTGGTCGGAGGGTGACTTGC-3’，β2引物為5’-TATTCCAATGCCGTGGTCTCC-3’和5’-TGGTCATCGTCCTCGCTC-3’，凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立神經(jīng)元煙堿型乙酰膽堿受體細(xì)胞模型的方法，其特征是，步驟④中檢測(cè)細(xì)胞克隆APP695，是指：

對(duì)RT-PCR挑選出的陽(yáng)性克隆，裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白；

用酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白濃度，取10μg上樣進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，用12％分離膠，5％積層膠，硝酸纖維素膜半干電轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)膜時(shí)間2h，小鼠抗人APP695單抗孵育3h，山羊抗小鼠二抗孵育1h，ECL熒光檢測(cè)，顯影定影并拍照。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立神經(jīng)元煙堿型乙酰膽堿受體細(xì)胞模型的方法，其特征是，步驟④中檢測(cè)Aβ，是指：

給藥6h后用含有蛋白酶抑制劑PMSF和AEBSF的裂解液裂解細(xì)胞；

BCA法測(cè)定蛋白濃度，取30.5μg上樣進(jìn)行Tris-tricine電泳，用16.5％分離膠，10％夾層膠，4％濃縮膠，PVDF膜濕轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜時(shí)間1h，6E10單抗室溫孵育3h，山羊抗小鼠二抗孵育1h，ECL熒光檢測(cè)，顯影定影并拍照。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立神經(jīng)元煙堿型乙酰膽堿受體細(xì)胞模型的方法，其特征是，所述的鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆上煙堿α4?β2受體的功能，是指：

對(duì)Western-bloting挑選出的APP695表達(dá)較高的細(xì)胞克隆進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)，采取傳統(tǒng)的全細(xì)胞記錄技術(shù)；鉗制電位為-60mV，低通濾波為2kHz，采樣濾波為5kHz，測(cè)試和記錄軟件用Axon?DigiData-1200A，結(jié)果分析用Axonscope?1.1.1軟件；通過(guò)微操縱器移動(dòng)快速給藥裝置的排管給藥，給予100μmol·L-1煙堿4s，觀察細(xì)胞上煙堿α4β受體通道活性。